豬傳染性胃腸炎病毒的分離鑒定及其基因組測序分析.pdf

1、豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV），屬于尼多病毒目冠狀病毒科Alpha病毒亞群，是一種具有囊膜結(jié)構(gòu)的單股正鏈RNA病毒，可以在豬的小腸上皮黏膜細(xì)胞胞漿中進(jìn)行復(fù)制，臨床上可以引起豬傳染性胃腸炎(Transmissiblegastroenteritis，TGE)。目前各豬場對TGE的防治均以免疫接種為主，但由于TGEV作為RNA病毒具有高突變、高重組的特點(diǎn)

2、，使得現(xiàn)階段使用的TGEV疫苗難以對豬群起到較好的免疫保護(hù)作用。因此對當(dāng)前臨床流行的TGEV分離鑒定及其生物學(xué)特性研究是研制新型高效疫苗的基礎(chǔ)。
　　本文對從齊齊哈爾市某豬場獲得的疑似感染TGEV病豬剖檢后的小腸病料進(jìn)行無菌處理后，在豬睪丸細(xì)胞(ST)上進(jìn)行盲傳培養(yǎng)鑒定，觀察到典型的特征性細(xì)胞病變(CPE)。根據(jù)RT-PCR和間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)成功分離了兩株TGEV流行毒株，將其分別命名為HE-1和HE-4。電子顯微鏡觀察病毒形

3、態(tài)，在胞漿中可以看到具有典型冠狀病毒形態(tài)特點(diǎn)的病毒粒子。
　　根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中報道的TGEV-HX序列，設(shè)計包含TGEV全基因組序列的13對交叉引物對TGEV HE-1、HE-4分離株結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白基因進(jìn)行擴(kuò)增;利用RACE試劑盒，對病毒基因組非編碼區(qū)5'UTR和3'UTR通過RT-PCR技術(shù)得到了相應(yīng)序列;對測序獲得的結(jié)果進(jìn)行序列拼接獲得病毒的全基因組序列。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示:TGEV分離株HE-1、HE-4

4、與國內(nèi)外目前報道的已上傳全基因組序列基因信息的TGEV病毒分離株具有較高的同源性，與國內(nèi)分離株AYU、HX、WH-1和國外分離株P(guān)urdue P115同源關(guān)系最高，達(dá)到99.8％，與變異株P(guān)RCV-ISU-1同源性最低為97.4％。建立了基于TGEV全基因組和不同單個基因的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，其中TGEV全基因組進(jìn)化樹結(jié)果顯示:分離株HE-1和HE-4都和TGEV Purdue群而不是與TGEV Miller群保持更近的親緣關(guān)系。TGEV各

5、毒株的不同基因進(jìn)化樹的進(jìn)化分支情況也有所差異，這可能是與不同基因在進(jìn)化過程中的保守性和變異情況有關(guān)。TGEV分離株HE-1、HE-4全基因組均由28580個核苷酸組成，具有典型冠狀病毒TGEV基因序列特征;5'和3'非編碼區(qū)相對保守，在非結(jié)構(gòu)基因ORF1a、ORF1b、ORF3a、ORF3b、ORF7未發(fā)生插入和缺失;在分別負(fù)責(zé)編碼結(jié)構(gòu)蛋白如膜結(jié)合蛋白(M)、核蛋白(N)和小膜蛋白(E)的基因上雖無插入和缺失現(xiàn)象發(fā)生，但是其分別有4、2