衍生自枯草芽孢桿菌MrpF的疏水多肽對(duì)蛋白膜錨定的研究.pdf

1、本研究研利用一種枯草芽孢桿菌膜蛋白MrpF作為膜錨定分子，錨定一些親水性蛋白到大腸桿菌細(xì)胞膜表面，本研究中選定了一種較為常用，穩(wěn)定且活性易于檢測(cè)的親水性蛋白PhoA來(lái)錨定。首先利用計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)了MrpF的結(jié)構(gòu)和疏水性。得出MrpF一種三次跨膜的膜蛋白依據(jù)計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)了PhoA-MrpF融合蛋白。通過(guò)基因克隆的方法從大腸桿菌內(nèi)克隆出phoA基因，然后通過(guò)基因融合的方法，將phoA基因融合于mrpF基因上游，構(gòu)建出PhoA-MrpF

2、融合蛋白的基因，再導(dǎo)入大腸桿菌誘導(dǎo)其表達(dá)。表達(dá)結(jié)果顯示融合蛋白表達(dá)良好，PhoA顯示出較高的酶活性。且在融合MrpF后，PhoA即被錨定在MrpF上。這一結(jié)果證明MrpF可以將PhoA錨定于細(xì)胞膜同時(shí)不會(huì)明顯影響PhoA的表達(dá)和活性。在此基礎(chǔ)上，對(duì)MrpF進(jìn)行截短改造。當(dāng)MrpF截至一個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域后，PhoA仍能表現(xiàn)出高度的活性，并且錨定于細(xì)胞膜。對(duì)MrpF進(jìn)一步截短，研究其能夠?qū)崿F(xiàn)PhoA膜錨定的最短長(zhǎng)度。為檢測(cè)PhoA錨定于細(xì)胞

3、膜的效率，發(fā)展了一些細(xì)胞處理和酶活檢測(cè)方法。一種是采用溶菌酶直接消化掉細(xì)胞壁，EDTA使外膜解體，從而使細(xì)胞周質(zhì)的PhoA直接暴露出來(lái)，游離的PhoA將被洗脫掉，錨地在膜上的PhoA則依然在細(xì)胞上從而被檢測(cè)到。另一種方法是滲透壓法(osmotic shock)。這種方法能夠?qū)⒅苜|(zhì)蛋白從周質(zhì)釋放出，但是如果PhoA被錨定在膜上，就不會(huì)被釋放。這兩種方法各自獨(dú)立，互相映證。在計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建出了一系列截短的MrpF與堿性磷酸酶的融合

4、蛋白。然后導(dǎo)入大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)。利用上述方法檢測(cè)其膜定位效率。研究結(jié)果指出，能實(shí)現(xiàn)PhoA膜定位的最短疏水標(biāo)簽長(zhǎng)度為8個(gè)氨基酸。
　　 本研究的結(jié)論可以從兩個(gè)方面闡述其意義。一是從理論方面，細(xì)胞蛋白跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制一直是生命科學(xué)研究的一個(gè)難題，到目前為止還沒(méi)有一個(gè)明確的理論解釋蛋白的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，膜蛋白的膜插入等機(jī)制，本研究得出了一個(gè)最短的膜錨定疏水多肽長(zhǎng)度，提示這個(gè)長(zhǎng)度可能是蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)中被識(shí)別的最短的終止轉(zhuǎn)運(yùn)序列，為這一類研究提供了部分