枯草芽孢桿菌芽孢萌發(fā)缺陷型工程菌的構(gòu)建.pdf

1、枯草芽孢桿菌芽孢是目前芽孢表面展示技術(shù)中最常用的載體，該技術(shù)通過(guò)將外源蛋白與芽孢衣殼蛋白融合在一起而達(dá)到芽孢表面展示的目的，可在芽孢表面展示外源蛋白、疫苗和生物催化劑等物質(zhì)。芽孢雖然具有抗逆性強(qiáng)，能應(yīng)對(duì)極端環(huán)境的特點(diǎn)，但是芽孢對(duì)外界環(huán)境也極其敏感，一旦探測(cè)到有適宜其萌發(fā)的條件就開(kāi)始萌發(fā)，恢復(fù)成營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，在恢復(fù)成營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的過(guò)程中芽孢衣殼會(huì)被降解脫落，導(dǎo)致芽孢表面展示的物質(zhì)脫離芽孢，失去活性。
　　本文對(duì)B. subtilis168發(fā)

2、酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以求獲得高密度的芽孢。通過(guò)單因素篩選實(shí)驗(yàn)，確定了B. subtilis168培養(yǎng)基的最佳碳源為麩皮，氮源為玉米漿，無(wú)機(jī)鹽分別為NaCl、K2HPO4、MgSO4。通過(guò)添加范圍的單因素試驗(yàn)確定各因素的最適添加濃度范圍后，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化麩皮、玉米漿、NaCl、K2HPO4、MgSO4的最佳配比。因Mn2+有促進(jìn)芽孢生成的作用，所以向正交試驗(yàn)確定出的培養(yǎng)基中添加不同濃度的MnSO4，確定MnSO4促進(jìn)芽孢生成的最

3、適濃度為2.4 mmol/mL。本文確定的B. subtilis168最佳產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基為：麩皮8 g/L，玉米漿20 g/L，NaCl4 g/L，K2HPO42 g/L，MgSO42.5 g/L，MnSO40.4 g/L。通過(guò)對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化得到B. subtilis168的最佳培養(yǎng)條件為初始pH值7.0、裝液量100/500 mL、溫度37℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min。優(yōu)化后的菌數(shù)達(dá)到3.9×109 CFU/mL，芽孢數(shù)達(dá)到3.6

4、×109 CFU/mL，產(chǎn)芽孢率為92％。
　　通過(guò)分析芽孢萌發(fā)相關(guān)基因，選擇對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢萌發(fā)過(guò)程中的皮層溶解酶基因sleB和cwlJ進(jìn)行敲除。首先以枯草芽孢桿菌168（Bacillus subtilis168）基因組為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增分別得到同源臂基因sleB1和cwlJ1，再以以卡那霉素(kmr)和博來(lái)霉素(zeor)作為抗性標(biāo)記基因，通過(guò)重疊延伸 PCR技術(shù)構(gòu)建sleB1-kmr和cwlJ1-zeor重疊片段并進(jìn)行

5、酶切和濃縮，經(jīng)過(guò)電轉(zhuǎn)和陽(yáng)性重組子篩選，成功獲得枯草芽孢桿菌芽孢萌發(fā)缺陷型工程菌B. subtilis168ΔsleBΔcwlJ。發(fā)酵研究表明：通過(guò)繪制菌體典型生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)重組菌的生長(zhǎng)比原始菌緩慢約2h；通過(guò)測(cè)定熒光強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)sleB和cwlJ基因的敲除對(duì)菌株形成芽孢無(wú)影響；在LB固體培養(yǎng)基中，原始菌的芽孢萌發(fā)數(shù)為5.9×108 CFU/mL，而重組菌芽孢未見(jiàn)萌發(fā)；在麥芽糖轉(zhuǎn)化生成海藻糖體系中，原始菌株轉(zhuǎn)化4h、8h、12h、16h后的