重癥急性胰腺炎大鼠肝損傷中NF-κB和Foxp3的表達及連翹對其影響.pdf

1、重癥急性胰腺炎（severeacutepancreatitis，SAP）作為常見的重癥疾病，病死率非常高，死亡主要的原因是細胞因子（如TNF-α）的激活、免疫功能的紊亂以及炎癥介質(zhì)的釋放。因血流動力學(xué)和解剖的關(guān)系，肝臟成為SAP最早累及的胰外器官之一，其并發(fā)肝損傷的機率可高達88.9％[1]，其機制主要是失控性炎癥反應(yīng)及機體免疫功能紊亂。而NF-κB在上述病變的發(fā)生過程中起著"信使"作用。作為重要的轉(zhuǎn)錄因子,NF-κB參與免疫反應(yīng)和淋巴

2、細胞分化,其活化可能調(diào)控著SAP的啟動。NF-κB信號通路對Foxp3表達的調(diào)控起著非常關(guān)鍵的作用，當(dāng)NF-κB被激活或信號強度增強時可直接促進Foxp3的表達和Treg細胞的增加，從而分泌大量的抑制性細胞因子來調(diào)節(jié)免疫功能的紊亂。SAP肝損傷重要的發(fā)病機制之一為腸源性內(nèi)毒素血癥，祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為內(nèi)毒素血癥在病機上為邪實正虛，所以治療應(yīng)是祛邪與扶正的有機結(jié)合[2]。連翹具有抗內(nèi)毒素、抗炎，又有其顯著的增強機體免疫和解毒系統(tǒng)對內(nèi)毒素予以解毒的

3、功效[3]。且目前尚未見在SAP肝損傷中應(yīng)用的報告。本實驗擬探討核因子(NF)-κB和Foxp3在重癥急性胰腺炎（SAP）肝損傷中的作用機制及連翹對其表達活性和SAP肝損傷保護的影響。
　　第一章重癥急性胰腺炎大鼠肝損傷中NF-κB和Treg的表達
　　研究目的：探討核因子(NF)-κB和CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）在重癥急性胰腺炎（SAP）肝損傷中的作用及其可能的機制。
　　實驗方法：雄性Wistar大

4、鼠48只，隨機分成假手術(shù)組（SO組）（n=24）和模型組（SAP組）（n=24）。SO組僅翻動胰腺，不注射牛黃膽酸鈉（NaTc），SAP組逆行性胰膽管注射?；悄懰徕c溶液（0.1ml/100g），SO組和SAP組均于術(shù)后3h、6h、12h在麻醉下處死大鼠，無菌操作法分別留取腹主動脈血、胰腺、肝臟的標(biāo)本待測。生化儀測各組血淀粉酶（AMY）及谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）水平，放射免疫法測血漿腫瘤壞死因子（TNF-α），鱟試劑法測血漿內(nèi)毒素含量，流式細

5、胞術(shù)測外周血Treg百分?jǐn)?shù)，對胰腺及肝臟進行病理學(xué)檢查及評分，RT-PCR法檢測肝臟組織中NF-κBmRNA和Foxp3mRNA表達量,并對上述所有指標(biāo)統(tǒng)計后進行分析。
　　主要結(jié)果：與SO組比較，SAP組中各項指標(biāo)均隨時間升高，并于12h達高峰，外周血中的Treg百分?jǐn)?shù)與血漿中的AMY、ALT及TNF-α的含量均隨時間明顯升高，SAP組的肝臟、胰腺有明顯的病理性改變，各時間點胰腺、肝臟病理學(xué)評分均顯著高于SO組（P<0.01）。

6、此外肝臟組織NF-κBmRNA的增高導(dǎo)致了Foxp3mRNA和外周血Treg表達明顯升高，呈時間依賴性和動態(tài)性，（p<0.01），NF-κBmRNA的表達與Treg呈正相關(guān)（r=0.738，p<0.01）。
　　主要結(jié)論：SAP可引起肝損傷，NF-κB高水平激活和Treg大量增多參與SAP肝損傷的發(fā)生。
　　第二章連翹對重癥急性胰腺炎大鼠肝損傷中NF-κB和Foxp3表達的影響
　　研究目的：研究各個濃度的連翹水煎液對

7、SAP大鼠肝損傷12h后的肝臟組織中NF-κB和Foxp3水平表達的影響，探討在用連翹干預(yù)后對SAP肝損傷大鼠中的NF-κB作用及免疫調(diào)節(jié)作用以及兩者之間的可能機制。
　　實驗方法：雄性Wistar大鼠48只，隨機分成假手術(shù)組（SO組）（n=8）、SAP組（n=8）和干預(yù)組（n=32），其中干預(yù)組分連翹高（AFS1組）、中（AFS2組）、低（AFS3組）劑量組和陽性對照組(PDTC組)。連翹干預(yù)組在造摸前7天開始給藥，給予連翹水煎

8、液H（5g/kg）、M（2.5g/kg）、L（1.25g/kg），每天一次，選用灌胃方式。陽性對照組于造摸前1小時給藥，100mg/Kg，腹腔注射。每組的模型制作及在12小時的時間點上留取的標(biāo)本均同第一章。測各組血淀粉酶（AMY）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）及TNF-α水平，鱟試劑法測血漿內(nèi)毒素含量，流式細胞術(shù)測外周血Treg百分?jǐn)?shù)，對胰腺及肝臟進行病理學(xué)檢查及評分，RT-PCR法檢測肝臟組織中NF-κBmRNA和Foxp3mRNA表達量，并

9、對上述所有指標(biāo)統(tǒng)計后進行分析。
　　主要結(jié)果：與SO組比較，SAP組外周血中的Treg百分?jǐn)?shù)與血漿中的AMY、ALT及TNF-α的含量均于12h時明顯升高，且肝臟、胰腺有明顯的病理性改變，同時胰腺、肝臟病理學(xué)評分均顯著高于SO組（P<0.01）。干預(yù)組（大鼠死亡率為0）肝臟組織中的上述指標(biāo)明顯下降，NF-κBmRNA和Foxp3mRNA表達的降低與Treg呈正相關(guān)（r=0.738，p<0.01）。隨連翹劑量增加，AMY、ALT及T

10、NF-α的含量均明顯降低，肝臟和胰腺組織炎癥明顯減輕，高劑量組和陽性對照組相比較無明顯差異（p>0.05）。
　　結(jié)論
　　1.采用5%?；悄懰徕c造模后，病理學(xué)檢測證實：胰腺和肝臟組織中出現(xiàn)了不同程度的壞死、水腫、出血及炎細胞浸潤，說明大鼠重癥急性胰腺炎造模成功。
　　2.隨SAP的發(fā)展，肝功能及病理損害進行性加重，證實SAP時出現(xiàn)了肝功能的障礙和肝損傷。
　　3.SAP的進行性發(fā)展可引起肝損傷，肝臟組織中NF-

11、κB、Foxp3的含量及外周血中Treg百分率升高，NF-κB高水平激活和Treg大量增多參與SAP肝損傷的發(fā)生。
　　4.SAP時，應(yīng)用連翹能顯著降低NF-κB的活性及肝臟組織中NF-κBmRNA和Foxp3mRNA的表達，減輕SAP肝損傷的嚴(yán)重程度。連翹通過抗炎、抗內(nèi)毒素作用及其顯著的增強機體免疫的功能對SAP大鼠的肝損傷起著重要的治療作用。
　　上述研究了NF-κB和Foxp3在重癥急性胰腺炎所致肝損傷中的作用機理及連