鱉甲煎改良方對大鼠肝纖維化的防治作用及其機制研究.pdf

1、目的：
　　 肝纖維化是多種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的共同病理過程，是慢性肝病發(fā)展到肝硬化的必經病理階段，防治肝纖維化是攻克肝硬化的突破口，從中醫(yī)藥中尋求有效的治療方法具有重要意義。轉化生長因子β（transforming growth factor beta，TGF-β）是一類調節(jié)細胞生長和分化的多肽，具有活化肝星型細胞（hepatic stellate cells，HSC），促進肝臟膠原基因表達，促進細胞外基質（extracel

2、lular matrix，ECM）合成等作用，是最重要的促肝纖維化因子之一。采用四氯化碳（carbon tetrachloride4，CCl4）誘導大鼠肝纖維化模型，觀察鱉甲煎改良方對大鼠肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）的防治作用及對TGF-β1、smad3和smad7蛋白及mRNA表達情況，探討其抗肝纖維化分子機制。
　　 方法：
　　 1．肝纖維化模型制備：SD 雄性大鼠90只，隨機取10只作為正常

3、對照組（A），其余大鼠用皮下注射40％四氯化碳（CCl4）橄欖油油劑0.3mL/100g 誘導大鼠肝纖維化模型8周，于第2周時隨機處死5只證實HF 形成后隨機分為肝纖維化模型組（B）、鱉甲煎改良方高劑量組（C）28.4g/（kg?d）、中劑量組（D）14.2g/（kg?d）、低劑量組（E）7.1g/（kg?d）、復方鱉甲軟肝片對照組（F）0.6g/（kg?d），每組15只。鱉甲煎改良方高、中、低劑量組和復方鱉甲軟肝片組給予1mL/（10

4、0g?d）相應藥液灌胃治療，A、B組同時給予等劑量的生理鹽水灌胃處理。
　　 2．標本收集及處理：8周后各組大鼠在3％戊巴比妥鈉以1ml/kg 體重腹腔注射麻醉，經股動脈采血測定血清丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）、白蛋白（albumin）和球蛋白（globulin）含量；并取同一部位肝組織用10％中性福

5、爾馬林固定，24小時后逐級酒精脫水，二甲苯透明，包埋、切片，作HE（hematoxylin-eosin）染色觀察肝纖維化程度變化并且運用免疫組化方法分析轉化生長因子β1（transforming growth factor betaone，TGF-β1）、Smad3及Smad7表達；取肝右葉組織二塊放入液氮罐中保存用以提取組織RNA及蛋白質。
　　 3．主要觀測指標與方法：試驗中每天觀察大鼠一般情況并稱重，應用EX7 全自動生化

6、測定儀檢測血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT），天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、白蛋白、球蛋白含量；HE 染色觀察肝纖維化程度，reverse transcriptase polymerase chainreaction（RT-PCR）檢測其轉化生長因子TGF-β1、受體Ⅰ、受體Ⅱ、Smad3及Smad7mRNA基因表達變化，免疫組織化學方法和Western-blot方法檢測各組組織中TGF-β1、smad3和smad7蛋白表達。
　　

7、 結果：
　　 1．8周后，成功復制大鼠肝纖維化模型，模型組肝纖維化形成明顯，肝小葉結構破壞，肝組織中膠原纖維含量和沉積明顯增加。與模型組比較，鱉甲煎改良方高、中、低劑量組和復方鱉甲軟肝片組肝小葉結構破壞明顯減輕，肝纖維化程度分級較模型組明顯好轉，膠原纖維所占面積顯著縮?。?3、24、24、26vs50）；模型組、鱉甲煎改良方高、中、低劑量組和復方鱉甲軟肝片組ALT和AST 含量顯著高于正常對照組（P<0.01）且模型組最高，

8、顯著高于其他各組（P<0.01），白蛋白含量則明顯低于正常對照組（P<0.01），模型組更低于其他各組（P<0.01）；鱉甲煎改良方高、中、低劑量組間比較無統(tǒng)計學意義，但與復方鱉甲軟肝片組比較有顯著差異（P<0.01）；各組球蛋白含量比較均無顯著性差異。
　　 2.RT-PCR 結果顯示，正常組大鼠肝組織三種基因都有較低水平的表達，而模型組大鼠肝組織TGF-β1、Smad3 mRNA表達顯著增強，smad7表達明顯減弱，與模型組

9、比較，鱉甲煎改良方高、中、低劑量組與復方鱉甲軟肝片組大鼠肝組織TGF-β1、Smad3表達減少（TGF-β1：0.3230±0.0039、0.3275±0.0057、0.3232±0.0035、0.3665±0.0158vs0.8761±0.0140；Smad3：0.1027±0.0043、0.0935±0.0046、0.1025±0.0019、0.1257±0.0030vs0.8105±0.0070），smad7表達明顯增強（0.51

10、00±0.0009、0.5099±0.0070、0.5093±0.0023、0.4979±0.0093vs0.1166±0.0128）。
　　 2．免疫組化及Western-blot 結果顯示，正常組大鼠肝組織有較少TGF-β1、smad3和smad7表達，模型組大鼠肝組織TGF-β1、Smad3蛋白表達明顯增強，而smad7表達明顯減弱；與模型組相比，鱉甲煎改良方各濃度組與復方鱉甲軟肝片組大鼠肝組織TGF-β1、Smad3表達

11、顯著減少（Western-blot：TGF-β1：0.127±0.014、0.122±0.051、0.126±0.027、0.119±0.020vs0.332±0.074，P<0.01；Smad3：0.415±0.057、0.427±
　　 0.074、0.425±0.080、0.432±0.075vs0.527±0.054，P<0.01），smad7蛋白的表達明顯增加（Western-blot：0.308±0.077、0.32

12、6±0.086、0.315±0.071、0.348±0.065vs0.185±0.059，P<0.01），且鱉甲煎改良方高、中、低劑量組和復方鱉甲軟肝片組間療效比較無明顯差異。
　　 結論：
　　 鱉甲煎改良方能夠顯著減輕CCl4 導致的大鼠肝纖維化程度，減少膠原纖維沉積和防止肝小葉結構破壞，顯著改善大鼠肝功能，尤其降低丙氨酸氨基轉移酶和天門冬氨酸氨基轉移酶含量，并且能夠明顯抑制大鼠肝組織中TGF-β1和Smad3 mR