白花丹醌對(duì)大鼠肝纖維化HSEC干預(yù)作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的：研究白花丹醌對(duì)CCl4聯(lián)合乙醇的大鼠肝纖維化模型干預(yù)作用，觀察白花丹醌干預(yù)前后大鼠肝纖維化模型肝臟HSEC窗孔數(shù)目、基底膜結(jié)構(gòu)變化，以及相關(guān)細(xì)胞因子內(nèi)皮素-1（END-1）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）等干預(yù)前后的變化。進(jìn)一步探討白花丹醌逆轉(zhuǎn)肝纖維化的機(jī)制，為白花丹醌治療肝纖維化作出理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：1.肝纖維化模型的制備：SD大鼠200只，雌性大鼠120只，雄性大鼠80只。隨機(jī)抽

2、取20只做空白對(duì)照組，空白對(duì)照組皮下注射生理鹽水，2次/周，連續(xù)4周，用量0.3ml/100g。其它大鼠皮下注射40%CCl4花生油，用量0.3ml/100g，第一次注射量加倍，2次/周，連續(xù)4周，造模期間大鼠僅食用含10%乙醇飲水。4周后，隨機(jī)抽取8只大鼠做肝組織病理HE染色，證實(shí)肝纖維化模型已經(jīng)建立成功。然后將造模成功的肝纖維化大鼠隨機(jī)抽取分組每組18只分別為：白花丹醌高劑量組，白花丹醌中劑量組，白花丹醌低劑量組，秋水仙堿組，丹參酚

3、酸B組，模型對(duì)照組，分別繼續(xù)造模并且同時(shí)灌胃給藥。第11周末將大鼠全部處死進(jìn)行解剖，取其肝臟和血液標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。
　　2.全自動(dòng)生化儀分析血清ALT、AST、TBIL、ALP的含量變化。
　　3.放射免疫法測(cè)定血清HA、P3NP、LN、CIV含量變化。
　　4.HE染色肝組織觀察肝纖維化程度及分期評(píng)分。
　　5.電子顯微鏡觀察HSEC超微結(jié)構(gòu)特征。
　　6.逆轉(zhuǎn)錄RT-PCR檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子mRNA

4、含量的改變。
　　結(jié)果：第一部分白花丹醌干預(yù)肝纖維化大鼠模型后肝功能相關(guān)指標(biāo)及 HE染色肝纖維化程度的改變
　　1.全自動(dòng)生化儀分析血清ALT、AST、TBIL、ALP的含量變化：肝功能檢測(cè)結(jié)果證實(shí)在第11周末用藥各組與模型對(duì)照組比較，血清 ALT、AST、TBIL、ALP值均下降，均有極顯著性差異(P＜0.01)；其中白花丹醌低劑量組第11周，隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)，ALT、AST、TBIL、ALP值逐漸降低，第11周末血清A

5、LT、AST、TBIL值與秋水仙堿、丹參酚酸B陽性對(duì)照組比較，有顯著性差異(P＜0.05)，ALP值與秋水仙堿、丹參酚酸B陽性對(duì)照組比較，無顯著性差異(P>0.05)。
　　2.放射免疫法測(cè)定血清HA、P3NP、LN、CIV含量變化：肝纖維化四項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果證實(shí)在第11周末用藥各組與模型對(duì)照組比較，血清HA、P3NP、LN、CIV值均下降，均有極顯著性差異(P＜0.01)；其中白花丹醌低劑量組第11周，隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)，HA、P3N

6、P、LN、CIV值逐漸降低，第11周末血清HA、P3NP、LN、CIV值與秋水仙堿、丹參酚酸B陽性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.HE染色肝組織觀察肝纖維化程度：空白對(duì)照組肝組織小葉結(jié)構(gòu)完整，輪廓清楚，肝細(xì)胞條索排列整齊，肝竇清晰。匯管區(qū)小葉間動(dòng)脈、靜脈和小葉間膽管未見擴(kuò)張、增生，也未見管腔狹窄、炎細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維組織增生。模型對(duì)照肝組織肝出現(xiàn)纖維化，肝小葉結(jié)構(gòu)不同程度破壞，肝小葉內(nèi)及匯管區(qū)出現(xiàn)不同程度的纖維

7、組織增生，少許炎細(xì)胞浸潤(rùn)，個(gè)別肝臟出現(xiàn)肝硬化，肝組織小葉結(jié)構(gòu)破壞，原有肝小葉結(jié)構(gòu)被纖維組織增生分割及包繞形成大小不等的圓形、橢圓形肝細(xì)胞團(tuán)即形成假小葉。白花丹高劑量組肝細(xì)胞脂變（肝細(xì)胞脂肪變性）：肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)脂滴，脂滴的大小不導(dǎo)致肝細(xì)胞外觀大小不一，最終引起肝細(xì)胞排列紊亂。肝細(xì)胞廣泛重度脂變，以中央 V為甚。白花丹醌中劑量組肝細(xì)胞大片中度脂變，以匯管區(qū)為主，肝細(xì)胞廣泛輕-中度水腫。白花丹醌低劑量組肝細(xì)胞出現(xiàn)水腫，肝細(xì)胞胞質(zhì)水份過多，

8、體積增大，胞漿淡染色，透亮度增加。秋水仙堿組肝細(xì)胞廣泛輕度水腫。丹參酚酸B組肝細(xì)胞出現(xiàn)輕中度中度片狀脂變。
　　4. HE染色肝組織觀察肝纖維化程度分期評(píng)分結(jié)果：與模型對(duì)照組比較各用藥組均可降低大鼠的肝纖維化評(píng)分，積分比較均有極顯著性差異(P＜0.01)；白花丹醌低劑量組與陽性對(duì)照組丹參酚酸B組比較，有顯著性差異(P＜0.05)，與秋水仙堿組比較無顯著性差異(P>0.05)。
　　第二部分白花丹醌干預(yù)肝纖維化大鼠模型后 HS

9、EC超微結(jié)構(gòu)特征的改變
　　電子顯微鏡進(jìn)行 HSEC超微結(jié)構(gòu)特征觀察結(jié)果：空白對(duì)照組肝臟HSEC呈篩孔狀結(jié)構(gòu)，有大量大小不一的窗口，大窗孔直徑約為1μm，小窗口約為0.1μm，皮下無基底膜；模型對(duì)照組HSEC窗口消失或大量減少，出現(xiàn)連續(xù)基底膜；白花丹醌高劑量組竇壁上窗口數(shù)量增多不明顯，且窗口直徑變大，基底膜減少不明顯，內(nèi)皮下基底膜成比連續(xù)狀；白花丹醌中劑量窗口數(shù)量增多，竇壁成篩孔狀，基底膜減少不明顯；白花丹醌低劑量組窗口數(shù)量增多，

10、竇壁成篩孔狀與中劑量組比較窗孔更多，基底膜減少明顯；秋水仙堿組和丹參酚酸B組窗口數(shù)量有少量增多，基底膜變化不明顯；
　　第三部分白花丹醌干預(yù)肝纖維化大鼠模型后相關(guān)細(xì)胞因子mRNA含量的改變
　　1.凝膠電泳觀察三種細(xì)胞因子CTGF、VEGF、END-1的mRNA在模型對(duì)照組的表達(dá)量均有明顯升高，藥物干預(yù)后三種細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)量均有下降。
　　2.光密度分析結(jié)果，用藥后各組細(xì)胞因子CTGF、VEGF、END-1的m

11、RNA的表達(dá)量降低，與模型對(duì)照組比較均有極顯著性差異（P<0.01），其中白花丹醌低劑量組CTGF、VEGF的mRNA表達(dá)含量與陽性對(duì)照組秋水仙堿和丹參酚酸比較，有顯著性差異或極顯著性差異（P<0.05或P<0.01），END-1的mRNA表達(dá)含量比較無顯著性差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.白花丹醌低劑量組在保護(hù)肝功能，降低肝纖維化程度，逆轉(zhuǎn)其病理變化，效果顯著。
　　2.白花丹醌低劑量組在恢復(fù)HSEC窗孔