鱉甲煎丸對(duì)肝纖維化大鼠的治療作用及其對(duì)細(xì)胞因子p38、CTGF、TIMP-1及MMP-9表達(dá)的影響.pdf

1、目的:肝纖維化(Hepaticfibrosis，HF)是在各種致病因子（酒精、病毒、藥物及自身免疫等）作用下引起的慢性肝損傷及肝臟進(jìn)行修復(fù)和愈合的結(jié)果，是向肝硬化發(fā)展的一個(gè)動(dòng)態(tài)過程及共同病理途徑，其特點(diǎn)是肝臟內(nèi)纖維結(jié)締組織異常增生，肝臟結(jié)構(gòu)破壞，肝竇毛細(xì)血管化與肝小葉內(nèi)纖維化，同時(shí)可引起肝功能減退及門靜脈高壓等;本質(zhì)是細(xì)胞外基質(zhì)(Extra-cellularmatrix，ECM)合成與分解失衡，ECM過度沉積。目前大量研究證明肝纖維化階

2、段是可逆的，及時(shí)阻止和逆轉(zhuǎn)肝纖維化的發(fā)生及發(fā)展可以大大降低肝硬化及肝癌的發(fā)生。肝星狀細(xì)胞(HSC)的激活是肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，而許多細(xì)胞因子參與肝星狀細(xì)胞的激活，如:結(jié)締組織生長因子(CTGF)、血小板衍生生長因子（Plateletderivativegrowthfactor，PDGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)，HSC被激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞(MFB)表達(dá)多種細(xì)胞因子受體，進(jìn)一步增殖，合成并分泌大量ECM，促使膠原

3、產(chǎn)生和沉積，從而導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生。目前雖然國內(nèi)外學(xué)者對(duì)肝纖維化的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了大量研究，但對(duì)肝纖維化的治療仍無特效藥物，隨著近年來國家對(duì)祖國醫(yī)學(xué)發(fā)展的重視，中醫(yī)藥對(duì)抗肝纖維化的治療顯示了較大的潛力。
　　 鱉甲煎丸出自東漢醫(yī)家張仲景所著《金匱要略·瘧病脈證并治第四》，具有軟堅(jiān)散結(jié)、化瘀通絡(luò)的功效。本實(shí)驗(yàn)通過經(jīng)典的四氯化碳(CCL4)造模方法建立肝纖維化模型，同時(shí)對(duì)模型進(jìn)行藥物干預(yù)，觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般情況變化，檢測(cè)血清層粘連蛋白

4、(LN)、Ⅳ型膠原(Col-Ⅳ)，血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、血清白蛋白(ALB)的含量，觀察肝臟病理學(xué)形態(tài)改變，檢測(cè)肝組織CTGF、P38、TIMP-1、MMP-9的水平，通過這些指標(biāo)的檢測(cè)，研究對(duì)肝纖維化的治療及可能的作用機(jī)制，為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:選取健康純種清潔級(jí)SD雄性大鼠56只，體重360-410g，由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為6組，包括正常組(A)、模

5、型組(B)、西藥組(C)、鱉甲煎丸低劑量組(D)、中劑量組(E)和高劑量組(F)。除正常組外，各組大鼠均于實(shí)驗(yàn)第1天皮下注射40％CC14橄欖油混合溶液5ml/kg，此后每3天注射3ml/kg，正常組大鼠皮下注射等量橄欖油，同時(shí)中藥及西藥各組每日給予中藥低、中、高劑量組大鼠鱉甲煎丸0.55g/(kg.d)、1.1g/(kg.d)、2.2g/(kg.d)，秋水仙堿0.1mg/kg灌胃。模型組大鼠給予蒸餾水灌胃。實(shí)驗(yàn)第四周末開始，每周隨機(jī)處

6、死模型組大鼠，光鏡下觀察肝臟病理學(xué)改變，實(shí)驗(yàn)第6周造模成功。造模成功后給予正常組、模型組、中藥各組大鼠及西藥組大鼠繼續(xù)灌胃5周，每日1次，藥物劑量根據(jù)體重調(diào)整。實(shí)驗(yàn)第11周末，各組大鼠禁食12小時(shí)，水合氯醛麻醉后心臟取血，離心后取血清，測(cè)定各組血清ALT、AST、ALB水平;放射免疫法檢測(cè)血清LN、Col-Ⅳ水平;取大鼠肝臟組織，分別用于HE染色及Masson染色，以觀察各組大鼠的肝臟病理形態(tài)學(xué)變化;選取大鼠相同部位肝組織置液氮中快速冷

7、凍后置于-80℃?zhèn)溆?，以反轉(zhuǎn)錄聚合酶聯(lián)反應(yīng)(reversetranscription-polymerasechainreactionRT-PCR)法檢測(cè)肝組織中CTGF、TIMP-1、MMP-9的水平;免疫組化方法檢測(cè)肝組織中P38蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1各組大鼠的一般情況
　　 在實(shí)驗(yàn)過程中，正常組大鼠體重呈持續(xù)性增長，飲食如常，目光有神，皮毛有光澤，反應(yīng)敏捷。模型組及中西藥各組大鼠一般狀況較差，反

8、應(yīng)遲鈍，皮毛暗淡，易激惹，形體消瘦。除正常組外，其余各組均有死亡情況:模型組死亡2只，中藥低、中、高劑量組、西藥組各死亡1只。
　　 2各組大鼠肝臟病理形態(tài)學(xué)改變
　　 光鏡下正常組大鼠肝臟中以肝細(xì)胞為主，肝細(xì)胞呈條索狀排列，圍繞中央靜脈呈放射狀排列，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞排列整齊。模型組大鼠肝細(xì)胞腫脹變性，部分呈氣球樣變，細(xì)胞邊界不清，胞質(zhì)不均勻或胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量空泡，小葉間纖維間隔較厚，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，中央靜脈周圍見有

9、少量灶狀壞死細(xì)胞，并伴有中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤;肝細(xì)胞核變形或稍固縮，匯管區(qū)纖維結(jié)締組織增生明顯，假小葉形成。中藥治療組雖有肝細(xì)胞損傷，結(jié)構(gòu)破壞，但較模型組明顯減輕，假小葉形成較少且結(jié)構(gòu)較清晰，肝竇輕度擴(kuò)張，匯管區(qū)纖維結(jié)締組織中度增生。秋水仙堿治療組肝臟損傷程度變化介于模型組與中藥組治療組之間。說明鱉甲煎丸對(duì)減輕肝纖維化效果明顯，且療效明顯優(yōu)于西藥治療組。
　　 3各組大鼠血清學(xué)指標(biāo)
　　 各組大鼠血清ALT

10、、AST含量結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比較，模型組、秋水仙堿組、中藥各劑量組大鼠血清中的含量明顯升高(P＜0.05);與模型組相比，秋水仙堿組、鱉甲煎丸各劑量組含量明顯降低(P＜0.05);與秋水仙堿組相比，鱉甲煎丸高劑量組明顯減低(P＜0.05)，低劑量組較之升高(P＜0.05)，中劑量組與之差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);鱉甲煎丸各劑量組之間相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，高劑量組最低，低劑量組最高，中劑量組居中。
　　

11、 各組大鼠血清ALB含量的結(jié)果顯示:與正常組相比，模型組、秋水仙堿組、鱉甲煎丸各劑量組明顯降低(P＜0.05);與模型組相比，秋水仙堿組、鱉甲煎丸中、高劑量組明顯升高(P＜0.05)，低劑量組與之差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);與秋水仙堿組相比，鱉甲煎丸高劑量組較之明顯升高(P＜0.05)，低劑量組較之明顯降低(P＜0.05)，中劑量組與之相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);鱉甲煎丸各劑量組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05):

12、高劑量組最高，低劑量組最低，中劑量組居中。
　　 4各組大鼠血清LN、Col-Ⅳ水平
　　 各組大鼠血清Col-Ⅳ水平顯示:與正常組相比，模型組、秋水仙堿組、鱉甲煎丸各劑量組明顯升高(P＜0.05);與模型組相比，秋水仙堿組、鱉甲煎丸中、高劑量組明顯降低(P＜0.05)，低劑量組與之差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);與秋水仙堿組相比，鱉甲煎丸高劑量組較之明顯降低(P＜0.05)，低劑量組較之明顯升高(P＜0.05)，中劑

13、量組與之相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);鱉甲煎丸各劑量組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05):高劑量組最低，低劑量組最高，中劑量組居中。
　　 各組大鼠血清LN水平顯示:與正常組相比，模型組、秋水仙堿組、鱉甲煎丸各劑量組明顯升高(P＜0.05);與模型組相比，秋水仙堿組、鱉甲煎丸各劑量組明顯降低(P＜0.05);與秋水仙堿組相比，鱉甲煎丸高劑量組較之明顯減低(P＜0.05)，低劑量組較之升高(P＜0.05)，中劑量組與

14、之差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);鱉甲煎丸各劑量組之間相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05):高劑量組最低，低劑量組最高，中劑量組居中。
　　 5各組大鼠肝組織中CTGFmRNA、TIMP-1mRNA、MMP-9mRNA含量的表達(dá)
　　 5.1各組大鼠肝組織中CTGFmRNA、TIMP-1mRNA含量的表達(dá)
　　 結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，模型組、秋水仙堿治療組、中藥各劑量組含量均升高(P＜0.05);與模型組進(jìn)

15、行比較，秋水仙堿組、鱉甲煎丸各劑量組表達(dá)均減低(P＜0.05);與秋水仙堿治療組相比，鱉甲煎丸高劑量組較之明顯減低(P＜0.05)，低劑量組較之表達(dá)升增高(P＜0.05)，中劑量治療組與之差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);鱉甲煎丸各劑量組之間相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，高劑量組最低，低劑量組最高，中劑量組居中。
　　 5.2各組大鼠肝組織中MMP-9mRNA含量的表達(dá)
　　 結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，模型組、秋水仙堿

16、組、鱉甲煎丸各劑量組明顯降低(P＜0.05);與模型組相比，秋水仙堿治療組、鱉甲煎丸各劑量組均降低(P＜0.05);與秋水仙堿組相比，鱉甲煎丸高劑量組較之表達(dá)高(P＜0.05)，低劑量治療組較之表達(dá)低(P＜0.05)，中藥中劑量組與之差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);鱉甲煎丸各劑量組之間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，高劑量組最高，低劑量組最低，中劑量組居中。
　　 6各組大鼠肝組織中P38蛋白的表達(dá)
　　 P38蛋白

17、陽性表達(dá)呈棕黃色，在正常大鼠肝臟組織的表達(dá)呈弱陽性表達(dá);與對(duì)照組比較，模型組、秋水仙堿治療組、鱉甲煎丸各劑量組明顯升高(P＜0.05);與模型組相比，秋水仙堿治療組、鱉甲煎丸各劑量組明顯降低(P＜0.05);與秋水仙堿組相比，鱉甲煎丸高劑量組較之明顯減低(P＜0.05)，低劑量組較之升高(P＜0.05)，中劑量組與之差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);鱉甲煎丸各劑量組之間相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05):高劑量組最低，低劑量組最高，

18、中劑量組居中。
　　 結(jié)論:
　　 1肝纖維化大鼠存在肝功能損傷及細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積。鱉甲煎丸可明顯減輕肝功能損傷及肝纖維化程度，有改善肝功能的作用。
　　 2鱉甲煎丸可明顯降低大鼠CTGF、TIMP-1的水平，減輕TIMP-1對(duì)MMP-9的抑制作用，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，減少細(xì)胞外基質(zhì)的合成，可能為其改善肝纖維化的機(jī)制之一。
　　 3鱉甲煎丸中藥可降低P38蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞的增殖、分化，阻斷肝纖