轉(zhuǎn)雙價(jià)抗紋枯病基因水稻新種質(zhì)創(chuàng)制.pdf

1、由立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kühn)引起的水稻紋枯病與稻瘟病、白葉枯病合稱為水稻三大病害。水稻自然品種中迄今未發(fā)現(xiàn)對(duì)該病原菌免疫和高抗的種質(zhì)，依靠傳統(tǒng)育種技術(shù)選育抗病品種的難度較大。本實(shí)驗(yàn)室前期研究顯示，在水稻中分別超表達(dá)藥用植物天麻中的一種抗真菌蛋白基因2（GAFP2，Gastrodia Antifungal Protein2）和水稻多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因1（OsPGIP1，Polygalacturon

2、ases inhibiting protein1）均可顯著增強(qiáng)水稻對(duì)紋枯病的抗性。進(jìn)一步聚合兩個(gè)基因并優(yōu)化其表達(dá)方式，有望篩選出表達(dá)更特異的抗紋枯病新種質(zhì)。為此，本研究采用水稻綠色組織特異表達(dá)啟動(dòng)子PrbcS和PcyFBpase分別驅(qū)動(dòng)OsPGIP1和GAFP2表達(dá)，構(gòu)建雙基因植物表達(dá)框“PrbcS::OsPGIP1—PcyFBpase::GAFP2”（以下簡稱雙價(jià)基因），并采用雙T-DNA植物表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化以篩選無標(biāo)記抗紋枯病轉(zhuǎn)基因

3、新種質(zhì)，主要結(jié)果如下:
　　1、在江蘇主栽粳稻品種武運(yùn)粳24號(hào)(WYJ24)和武陵粳1號(hào)(WLJ1)中累計(jì)獲得陽性轉(zhuǎn)基因植株131株(T0)，根據(jù)農(nóng)藝表型及育性表現(xiàn)初步篩選，最終保留114個(gè)陽性轉(zhuǎn)基因系(T1)，其中WLJ1背景53個(gè)，WYJ24背景61個(gè)。
　　2、通過Southern Blot對(duì)轉(zhuǎn)基因系中的外源基因拷貝數(shù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)轉(zhuǎn)基因系中攜帶外源基因數(shù)為3拷貝及以上，單、雙拷貝轉(zhuǎn)基因系分別僅有15和9個(gè)。篩

4、選到靶基因單拷貝的無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因系4個(gè)，靶基因單拷貝篩選標(biāo)記也為單拷貝的轉(zhuǎn)基因系5個(gè)。對(duì)各轉(zhuǎn)基因系中的靶基因表達(dá)水平進(jìn)行RT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)轉(zhuǎn)基因系中的靶基因在葉片中的mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯高于對(duì)照品種，且表達(dá)水平與拷貝數(shù)間沒有相關(guān)性?；虮磉_(dá)部位分析結(jié)果顯示，靶基因主要在葉片、幼穗、葉鞘和莖中強(qiáng)表達(dá)，而在根與種子中表達(dá)較弱或不表達(dá)。通過Western Blot，發(fā)現(xiàn)各單拷貝轉(zhuǎn)基因系中均積累較強(qiáng)的GAFP2蛋白。這些結(jié)果表明，雙價(jià)基

5、因成功整合至水稻基因組中且主要在水稻綠色組織中強(qiáng)表達(dá)。
　　3、對(duì)21個(gè)單拷貝和雙拷貝轉(zhuǎn)基因系進(jìn)行紋枯病菌接種鑒定。田間鑒定結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)基因系的發(fā)病情況總體輕于對(duì)照，病級(jí)差異達(dá)到顯著水平;相對(duì)于對(duì)照品種，轉(zhuǎn)基因系的病級(jí)平均最少降低了0.3級(jí)，最高降低了2.8級(jí)，平均減輕1.6級(jí)。部分轉(zhuǎn)基因系進(jìn)行了室內(nèi)離體接種鑒定，結(jié)果顯示，多數(shù)轉(zhuǎn)基因系的病斑長度顯著短于對(duì)照品種。室內(nèi)離體鑒定與田間鑒定結(jié)果趨勢(shì)基本一致。這些結(jié)果表明，本研究中的雙價(jià)

6、基因確實(shí)可顯著增強(qiáng)水稻對(duì)紋枯病的抗性。
　　4、初步考察了21個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的主要農(nóng)藝性狀和生育期，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)株系與對(duì)照相比在一個(gè)或多個(gè)性狀上存在一定的差異，但不同轉(zhuǎn)化子間很少出現(xiàn)一致的性狀變異，表明多數(shù)轉(zhuǎn)化子后代株系的性狀可能是由組培變異引起的，而不是外源基因直接引起的。通過篩選，獲得了少數(shù)與對(duì)照親本基本接近或綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)異的轉(zhuǎn)基因系。
　　5、采用反向PCR策略對(duì)13個(gè)單拷貝轉(zhuǎn)基因系中的靶基因插入位置進(jìn)行分析，共獲得5個(gè)