轉(zhuǎn)雙價(jià)抗蟲(chóng)基因棉花的獲得、檢測(cè)和基因表達(dá)研究.pdf

1、y7 8 3 5 2 9四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩i - 學(xué)位論文轉(zhuǎn)雙價(jià)抗蟲(chóng)基因棉花的獲得、檢測(cè)和基因表達(dá)研究孫善君指導(dǎo)教師至垡重墼塑! 四』l l 墨些盔堂!鹽墼三型塑旦! 主國(guó)盟堂墮焦塑嬰基廈!學(xué)科專(zhuān)業(yè) 堡塑壟焦量亙壁研究方向 植物基因工程與育種2 0 0 5 年5 月四川農(nóng)業(yè)大學(xué)中；國(guó)科學(xué)院植物研究所摘 要棉花的生產(chǎn)周期長(zhǎng)，蟲(chóng)害損失大，常年達(dá)1 0 —1 6 ％，災(zāi)害年份可達(dá)3 0 ％。防治蟲(chóng)害長(zhǎng)期大量使用化學(xué)農(nóng)藥不但增加了棉花生產(chǎn)成本，還易

2、引起害蟲(chóng)抗藥性增強(qiáng)、環(huán)境污染、生態(tài)平衡破壞等一系列嚴(yán)重問(wèn)題。轉(zhuǎn)基因改良棉花可以將抗蟲(chóng)基因分離克隆導(dǎo)入棉花而增強(qiáng)棉花自身的抗蟲(chóng)性，從而可以節(jié)省生產(chǎn)成本，保護(hù)環(huán)境。目前在植物抗蟲(chóng)基因工程中常見(jiàn)的外源抗蟲(chóng)基因有蘇云金芽孢桿菌( 口t ) 殺蟲(chóng)蛋白基因、蛋白酶抑制劑( 仃) 基因、淀粉酶抑制劑( 彳，) 基因、外源凝集素基因、脂肪氧化酶基因以及蝎毒素、蜘蛛毒素基因等。其中蘇云金芽孢桿菌( 所) 殺蟲(chóng)蛋白基因、蛋白酶抑制劑( Ⅳ) 基因和外源凝集

3、素基因在棉花抗蟲(chóng)基因工程中應(yīng)用最多。本實(shí)驗(yàn)利用花粉管通道方法將蘇云金芽孢桿菌( 口t ) 殺蟲(chóng)蛋白基因和雪花蓮?fù)庠茨? g n a ) 基因轉(zhuǎn)化到棉花中，提高棉花對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)的抗性和對(duì)桃蚜的耐性。以棉花品系S N 為材料，將p B S G S l M 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入受體大腸桿菌D H 5 n 中，擴(kuò)增后提取質(zhì)粒D N A ，待棉花盛花期時(shí)，利用花粉管通道轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒D N A 注射到授粉2 0 h 左右的子房中。將收獲的種子浸泡萌發(fā)后植于

4、溫室，經(jīng)過(guò)田間卡那霉素篩選，獲得了1 2 株轉(zhuǎn)基因植株。P C R 、S o u t h e r n b l o t t i n g 檢測(cè)結(jié)果表明，B t 和g n a 基因已經(jīng)整合到棉花基因組中。對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行蟲(chóng)試的結(jié)果表明，受試植株上的棉鈴蟲(chóng)在5 d 內(nèi)的校正死亡率超過(guò)了8 0 ％，而且存活幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育受到明顯的抑制；轉(zhuǎn)化植株具有較強(qiáng)的抗蚜活性，平均能夠抑制桃蚜6 0 ％以上的蚜口密度，最高的高達(dá)7 0 ％。結(jié)果表明，利用改造的抗

5、蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)化棉花植株已獲得既抗蟲(chóng)又耐蚜的轉(zhuǎn)基因的棉花。對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花的苗期倒3 葉、苗期倒5 葉、現(xiàn)蕾期功能葉、花期功能葉、根、莖皮、鈴皮、鈴內(nèi)容物、花苞片、花瓣進(jìn)行三明治E L I S A 撿i 貫! l ，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因檀株均有不同程度的耽殺蟲(chóng)蛋白表達(dá)。外源基因在植株各部位或不同的組織器官表達(dá)有顯著的差異，其中在現(xiàn)蕾期功能葉達(dá)到2 9 2 3 ．7 n g ／g 鮮重。另外，歲} 源基因的表達(dá)量存在時(shí)間和空間的不同分布。轉(zhuǎn)化用的表達(dá)載體