矮牽牛轉(zhuǎn)ACA與GNA雙價(jià)抗蚜蟲基因的研究.pdf

1、西南林學(xué)院2006屆碩士研究生學(xué)位論文y950506矮牽牛轉(zhuǎn)ACA與GNA雙價(jià)抗蚜蟲基因的研究TransformationofPetuniahybridaContainingACAandGNAGene劉小珍指導(dǎo)教師：李桐森教授西南林學(xué)院學(xué)位授予單位：西南林學(xué)院云南昆明轉(zhuǎn)化率也增加；在共培養(yǎng)天數(shù)為4天時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)到峰值，達(dá)到538％；麗后轉(zhuǎn)化率有所下降。所以，就矮牽牛而言，共培養(yǎng)時(shí)間以4d最佳。為了增加篩選的準(zhǔn)確性，我們選擇卡那濃度為lO

2、Omg／L作為轉(zhuǎn)基因矮牽牛的篩選濃度。在含有500mg／LCeflOOma／LKan的選擇培養(yǎng)基上，愈傷組織的生長(zhǎng)明顯受到抑制，表現(xiàn)為愈傷組織形成延遲，大約15天才見有少量愈傷形成，一個(gè)月后才有大量愈傷組織產(chǎn)生；只有一部分葉片組織脫分化形成愈傷組織。未轉(zhuǎn)化組織在相同選擇培養(yǎng)基上不能形成愈傷組織。4對(duì)轉(zhuǎn)基因再生植株進(jìn)行了卡那霉素抗性分析、PCR、PCR酶切和蟲試檢測(cè)。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，獲得了一些轉(zhuǎn)基因矮牽牛植株。當(dāng)幼苗長(zhǎng)至3—5片真時(shí)時(shí)，

3、將其轉(zhuǎn)至降低瓊脂含量的胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根。將根系發(fā)育良好的植株經(jīng)煉苗2周后，移栽至土中。用濃度為1000mg／L卡那霉紊點(diǎn)滴于轉(zhuǎn)化再生苗生長(zhǎng)點(diǎn)，其中42棵導(dǎo)入pC&MBIA2300AG的矮牽牛再生苗中有36棵幼苗沒有發(fā)生任何變化。而對(duì)照幼苗和6棵轉(zhuǎn)基因矮牽牛新生真葉上則出現(xiàn)了黃色斑塊。重復(fù)2次，觀察結(jié)果一致。挑選20棵轉(zhuǎn)基因植株以特異引物對(duì)GNA基因和ACA基因進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR檢測(cè)結(jié)果表明pCAMBIA2300AG轉(zhuǎn)化再生矮

4、牽牛植株全部為GNA基因陽(yáng)性。但其中有4株GNA檢測(cè)為陽(yáng)性的植株，在檢測(cè)ACA時(shí)卻表現(xiàn)為陰性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證GNA和ACA基因的PCR結(jié)果是真陽(yáng)性還是假陽(yáng)性，我們利用PCR酶切方法進(jìn)行了進(jìn)一步檢測(cè)。結(jié)果表明從轉(zhuǎn)基因植株基因組中擴(kuò)增出的GNA基因和ACA基因均是真陽(yáng)性。蟲試結(jié)果表明pCAMBIA2300一AG的轉(zhuǎn)化再生矮牽牛中不抗、中低抗以及高抗植株所占比例分別為20％，30％和50％。pCAMBIA2300AG的轉(zhuǎn)基因植株對(duì)蚜蟲具有明顯