先天性黑蒙癥致病基因Nmnat1復(fù)合雜合突變小鼠各組織中nmnat1與sirt1基因表達(dá)研究和SMN1基因新突變導(dǎo)致脊髓性肌萎縮癥.pdf

1、本文分為兩個(gè)部分進(jìn)行探討：
　　第一部分 先天性黑蒙癥致病基因Nmnat1復(fù)合雜合突變小鼠各組織中nmnat1與sirt1基因表達(dá)
　　背景:先天性黑蒙癥(Leber's congenital amaurosis,LCA)是一類導(dǎo)致視網(wǎng)膜病變的眼部疾病,患兒一般在出生時(shí)或出生一年后呈現(xiàn)嚴(yán)重的視力障礙。該病多是常染色體隱形遺傳病,目前研究報(bào)道了約18種與先天性黑蒙相關(guān)的致病基因。本課題組通過高通量測序和外顯子捕獲技術(shù),發(fā)現(xiàn)了N

2、MNAT1基因突變會導(dǎo)致9型先天性黑蒙癥發(fā)生。NMNAT1基因通過編碼一類催化NAD+合成的關(guān)鍵酶類—煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶,參與NAD+依賴的多種代謝過程。SIRT1是一類NAD+依賴的去乙?；?可進(jìn)行NAD+依賴性的去乙?；磻?yīng),并參與代謝疾病,惡性腫瘤,心血管疾病以及神經(jīng)性疾病等多種疾病的調(diào)節(jié)機(jī)制。研究報(bào)道顯示,NMNAT1基因可與SIRT1直接相互作用,將NAD+轉(zhuǎn)移至SIRT1,從而發(fā)揮去乙?；δ?。由此可見,NMNAT

3、1蛋白與SIRT1蛋白之間是緊密聯(lián)系的。
　　目的:研究發(fā)現(xiàn)NMNAT1蛋白在多種組織中廣泛表達(dá),其中在視網(wǎng)膜,肝臟,睪丸,骨骼肌等組織中表達(dá)量較高。本文通過選取NMNAT1基因突變(c.769G＞A和c.454G＞T)位點(diǎn)敲入小鼠來研究NMNAT1與SIRT1在成年突變小鼠全身各組織臟器中表達(dá)水平的差異和組織學(xué)水平的異常。以期了解NMNAT1基因突變對除眼睛外其它組織的損傷情況。
　　方法:建立NMNAT1基因(c.769

4、G＞A和c.454G＞T)復(fù)合雜合突變的小鼠模型。小鼠出生一周后剪取尾巴或腳趾提取基因組DNA,通過Sanger測序驗(yàn)證小鼠基因型。NMNAT1基因(c.769G＞A和c.454G＞T)復(fù)合雜合突變小鼠和對照組同時(shí)培育至20周(之前實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)20周老鼠黑蒙癥表型最為嚴(yán)重),解剖收集各組織獲取組織RNA,并通過熒光定量PCR技術(shù)檢測小鼠各組織RNA表達(dá)水平的差異。選取差異較大的組織,運(yùn)用免疫組化檢測蛋白表達(dá)位置及水平變化,HE染色結(jié)果

5、觀察相應(yīng)組織細(xì)胞是否有形態(tài)學(xué)病理學(xué)上的病變結(jié)果:NMNAT1基因(c.769G＞A和c.454G＞T)復(fù)合雜合突變小鼠的NMNAT1和SIRT1基因在肝臟和睪丸的組織的表達(dá)量明顯下調(diào),并表現(xiàn)出顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,在其他組織包括眼睛,肌肉,心臟,腎臟等中沒有顯著差異。免疫組化結(jié)果同樣顯示突變小鼠NMNAT1和SIRT1表達(dá)水平下調(diào)。HE染色結(jié)果表明突變小鼠的睪丸和肝臟組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)改變。
　　結(jié)論:先天性黑蒙癥致病基因NMNAT1(c

6、.769G＞A和c.454G＞T)復(fù)合雜合突變除了對于視網(wǎng)膜造成嚴(yán)重?fù)p傷外,同時(shí)會對于肝臟組織和睪丸組織帶來一定程度的損傷,這兩個(gè)組織的嚴(yán)重?fù)p傷可能是由于NMNAT1基因突變引起SIRT1表達(dá)異常所導(dǎo)致。
　　第二部分 SMN1基因新發(fā)突變導(dǎo)致脊髓性肌萎縮癥(SMA)
　　背景:脊髓性肌萎縮(Spinal muscular atrophy, SMA)是一類常染色體隱性遺傳病,常伴隨有運(yùn)動神經(jīng)元的退行,骨骼肌的萎縮以普遍的肌肉

7、無力。該病主要由于神經(jīng)元存活基因(Survival motor neuronl,SMN1)發(fā)生缺失或突變所導(dǎo)致。
　　目的:在本研究中我們收集了3個(gè)脊髓性肌萎縮癥的患病家系,通過多種篩查手段探測家系中的先證者致病信息以及攜帶者信息,為這些家系后期的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供臨床實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。
　　方法:采集先證者以及先證者親屬外周血樣并獲取全基因組DNA,運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行SMN1基因拷貝數(shù)篩查。全血RNA提取并反轉(zhuǎn)錄為c

8、DNA,通過設(shè)計(jì)合適引物和Sanger測序檢測家系中的致病點(diǎn)突變。質(zhì)粒構(gòu)建以及后續(xù)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證點(diǎn)突變造成SMN蛋白定位和功能上的改變,并結(jié)合生物信息學(xué)來說明點(diǎn)突變導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)異常以及致病性。
　　結(jié)果:發(fā)現(xiàn)了一個(gè)SMN1基因新的突變位點(diǎn)c.728_729delTT(p.Ile243Thrfs 12),該突變會導(dǎo)致第243位氨基酸從異亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘K氨酸并且提前終止形成截短蛋白。細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)表明該突變會造成SMN蛋白定位異常。再結(jié)合

9、蛋白功能預(yù)測分析結(jié)果確定突變c.728 729delTT為致病突變。另外,在篩查一個(gè)家系的攜帶者時(shí)發(fā)現(xiàn)了中國家庭中罕見的“2+0”模式(即一條染色體上帶有2個(gè)SMN1基因,另一條染色體上沒有SMN1)。最后一個(gè)家系的先證者為常見的SMN1基因7號外顯子缺失。
　　結(jié)論:本課題組發(fā)現(xiàn)了一個(gè)未曾被報(bào)道過的SMN1基因新發(fā)突變c.728_729delTT(p.Ile243Thrfs12),經(jīng)過細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證以及生物信息分析均表明該突變?yōu)?/p>