先天性膽汁酸合成障礙1型和2型臨床特征及基因突變研究.pdf

1、本文主要從以下三個部分展開論述：
　　第一部分 先天性膽汁酸合成障礙1型和2型臨床特征及基因突變譜
　　目的:探索先天性膽汁酸合成障礙(CBAS)1型和2型在中國兒童和青少年肝內(nèi)膽汁淤積癥病因中的地位，分析CBAS1型和2型臨床特征與基因突變譜，為早期診斷提供線索。
　　方法:2009年1月至2014年1月在我院肝病門診就診，表現(xiàn)為膽汁淤積癥或曾有膽汁淤積癥，臨床考慮膽汁酸合成障礙可能或不明原因肝內(nèi)膽汁瘀積癥者，采用尿

2、液膽汁酸譜分析，基因檢測和全外顯子組測序技術(shù)診斷膽汁酸合成障礙。確診CBAS1型和2型病例為研究對象，基因確診的PFIC1型和2型，或曾行尿液膽汁酸譜分析除外膽汁酸合成障礙者為對照組，收集患兒詳細(xì)臨床資料，回顧性分析臨床及生化指標(biāo)并進行統(tǒng)計學(xué)檢驗，P值＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:10例CBASl患兒HSD3B7基因檢測到14種突變，除c.4546delAG外均為新發(fā)現(xiàn)的突變，包括G88R、S162P、R228Q、P264T

3、、P264T、T323M、Y344C、W360X、c.474delC、c.544delC、c.544insC、c.988-990delACC、c.1040delT。5例CBAS2患兒AKR1D1基因檢測到6種突變，Y132X為無義突變，933delG為移碼突變，R266Q與日本報道患兒相同，D53G、D241V和R307C為新發(fā)現(xiàn)的錯義突變。CBAS1和2患兒存在腎臟結(jié)構(gòu)異常的比例(6/12，50％)明顯高于PFIC1和2患兒(1/21

4、)（P值為0.005）。CBAS1和2患兒GGT中位值為44 IU/L(8IU/L-70 IU/L)和TBA中位值為88.25μmol/L(7.1μmol/L-392.1μmol/L)，明顯低于曾行尿液膽汁酸譜分析排除CBAS患兒(P值分別為0.0036與0.000)。其他生化指標(biāo)差異無顯著性。經(jīng)CDCA治療后，多數(shù)CBAS1型和2型患兒黃疸消失，生化指標(biāo)恢復(fù)正常，尿液膽汁酸譜恢復(fù)正常。
　　結(jié)論:本研究確診10例CBAS1和5例

5、CBAS2患兒，證實了CBAS1和2是我國兒童和青少年肝內(nèi)膽汁淤積癥的重要病因。CBAS1和2基因突變譜廣泛。腎臟結(jié)構(gòu)異常是一種值得注意的臨床表現(xiàn)，血清低GGT與低TBA是CBAS1和2型的主要生化特征。早期采用CDCA治療效果顯著。
　　第二部分 AKRlD1基因錯義突變對酶蛋白功能影響的初步探索
　　目的：編碼Δ4-3-氧固醇-5β-還原酶的AKR1D1基因4種突變D53G、D241V、R266Q和R307C是本課題組檢

6、出的新突變，本研究應(yīng)用體外表達的方法對這4種錯義突變進行功能分析，初步探索其突變效應(yīng)和致病性質(zhì)。
　　方法：(1)從肝臟手術(shù)廢棄組織中獲得AKR1Dl cDNA;(2)構(gòu)建野生型表達質(zhì)粒pcDNA4-AKRlDl;(3)應(yīng)用定點誘變技術(shù)構(gòu)建含有4種突變型AKRlDl cDNA的表達載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，抽提質(zhì)粒并測序驗證;(4)使用pcDNA4.0-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與HEK293細(xì)胞摸索最佳轉(zhuǎn)染條件;(5)將含有野生型和突變型

7、AKRlD1cDNA的表達載體pcDNA4瞬時轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞;(6)轉(zhuǎn)染48小時后抽提蛋白質(zhì)，應(yīng)用免疫印跡法檢測蛋白表達量。以野生型AKRlD1作為參照，計算突變型AKRlD1蛋白的相對表達量。各組間統(tǒng)計比較使用t檢驗。
　　結(jié)果：(1)成功構(gòu)建了含有AKRlD1基因的野生型及4種突變型質(zhì)粒:pcDNA4.0-AKR1D1質(zhì)粒，pcDNA4.0-AKRlD1-D53G質(zhì)粒，pcDNA4.0-AKRlDl-D241V質(zhì)粒，pc

8、DNA4.0-AKRlDl-R266Q質(zhì)粒，pcDNA4.0-AKRlDl-R307C質(zhì)粒;(2)野生型和突變型AKRlD1蛋白過表達于HEK293細(xì)胞; pcDNA4.0-AKRlDl-D53G和pcDNA4.0-AKR1D1-D241V蛋白表達量高于pcDNA4.0-AKRlD1(P值分別為0.041，0.032)，pcDNA4.0-AKRlDl-R266Q和pcDNA4.0-AKRlDl-R307C蛋白表達量與pcDNA4.0-A

9、KR1D1蛋白表達量無明顯差異（P值分別為0.485，0.155）。
　　結(jié)論：成功表達野生型及突變型的AKRlD1于HEK293細(xì)胞，4個錯義突變蛋白表達量無明顯降低，對酶功能的影響需要進一步進行酶活性研究。
　　第三部分 先天性膽汁酸合成障礙2型一家系突變分析及產(chǎn)前診斷
　　目的：分析已確診的先天性膽汁酸合成障礙2型患兒一家系A(chǔ)KRlD1基因突變情況，探索采用羊水細(xì)胞DNA測序進行產(chǎn)前診斷的可行性。
　　方法

10、：采集患兒父母外周血標(biāo)本，第二胎妊娠20周胎兒羊水細(xì)胞及培養(yǎng)兩周后細(xì)胞，提取基因組DNA，擴增AKRlD1基因外顯4和外顯子7的編碼區(qū)及側(cè)翼序列，采用Sanger法直接雙向測序。采集胎兒出生后外周血標(biāo)本及小便標(biāo)本，分別采用血生化化驗、尿膽汁酸譜分析和突變位點檢測進行驗證。
　　結(jié)果：患兒為AKRlD1基因，c.396C＞A和c.722A＞T復(fù)合雜合突變組，患兒父親攜帶AKRlD1基因c.396C＞A雜合突變，患兒母親攜帶AKRlD