先天性甲狀腺功能減低癥患者PAX8基因突變篩查及致病機(jī)理研究.pdf

1、先天性甲狀腺功能減低癥（以下簡(jiǎn)稱甲低）是新生兒常見(jiàn)的內(nèi)分泌性疾病之一，其中甲狀腺發(fā)育不全導(dǎo)致的甲低占先天性甲低的85％，而甲狀腺特異轉(zhuǎn)錄因子在胚胎期甲狀腺分化和發(fā)育中發(fā)揮重要作用， PAX8是甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子之一，PAX8蛋白在胚胎早期甲狀腺濾泡分化中發(fā)揮重要作用，而且對(duì)成人甲狀腺細(xì)胞分化狀態(tài)的維持也是必需的。PAX8基因突變會(huì)導(dǎo)致PAX8蛋白功能異常，從而影響甲狀腺發(fā)育導(dǎo)致甲低。
　　 迄今為止，在PAX8中發(fā)現(xiàn)的突變至少有10

2、個(gè)，其中第3、4外顯子是突變熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)第一部分對(duì)中國(guó)山東地區(qū)先天性甲狀腺功能減低癥患者PAX8第4外顯子進(jìn)行基因突變篩查，闡明中國(guó)山東地區(qū)甲低患者PAX8基因第4外顯子突變特點(diǎn)。453例標(biāo)本來(lái)自山東省甲狀腺發(fā)育不全的先天性甲低患者，從外周血白細(xì)胞中提取全基因組DNA擴(kuò)增PAX8第4外顯子，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序。分析453例PAX8第4外顯子測(cè)序結(jié)果，在1例患者第4內(nèi)含子發(fā)現(xiàn)1個(gè)IVS4+83 T＞C突變，在第4內(nèi)含子區(qū)發(fā)現(xiàn)1個(gè)SN

3、P位點(diǎn)（rs74370449，IVS4+101G/A，變異頻率為8.9％），在1例病例中發(fā)現(xiàn)1個(gè)錯(cuò)義突變c.280G＞A，p.D94N。PAX8基因第4外顯子突變率在中國(guó)山東地區(qū)甲低患者中很低。
　　 PAX8突變導(dǎo)致甲低的致病機(jī)理并不清楚。本實(shí)驗(yàn)第二部分對(duì)本課題組在PAX8中發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)突變(c.122G＞T，p.G41V;c.280G＞A，p.D94N)進(jìn)行功能學(xué)研究。構(gòu)建PAX8野生型和突變型真核表達(dá)載體、TPO和TG啟動(dòng)子

4、區(qū)熒光素酶報(bào)道基因表達(dá)載體，接種Hela細(xì)胞，轉(zhuǎn)染PAX8野生型或突變型表達(dá)載體，同時(shí)轉(zhuǎn)染TPO或TG啟動(dòng)子區(qū)表達(dá)載體，以海腎熒光素酶表達(dá)載體為轉(zhuǎn)染內(nèi)參。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，裂解收集細(xì)胞，Dual-Luciferase Reporter Assay System測(cè)定熒光強(qiáng)度，研究PAX8基因錯(cuò)義突變對(duì)TPO、 TG啟動(dòng)子區(qū)激活能力的影響;野生型和突變型PAX8真核表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，48h后收集、裂解細(xì)胞，提取總蛋白，Wester

5、n blotting檢測(cè)PAX8蛋白表達(dá)，與野生型比較分析得出突變體PAX8蛋白表達(dá)的改變;熒光定量PCR檢測(cè)PAX8RNA表達(dá)量差異。結(jié)果表明:兩個(gè)突變體的表達(dá)量都有所下降，D94N對(duì)TPO啟動(dòng)子區(qū)的激活能力顯著下降(P＜0.01)，對(duì)TG啟動(dòng)子區(qū)激活能力影響不大，與野生型PAX8共轉(zhuǎn)染，對(duì)TPO、 TG激活能力，相對(duì)于純合型來(lái)說(shuō)有所提高，但不明顯，相對(duì)于野生型有所降低;突變體G41V對(duì)TPO、TG啟動(dòng)子區(qū)激活能力都顯著下降(P＜0.