RFP13誘導細胞凋亡的調(diào)控.pdf

1、細胞凋亡是所有多細胞生物自身調(diào)控的一種復雜的遺傳和生化過程。在胚胎發(fā)育，組織分化過程中起重要作用。細胞凋亡對成年組織保持正常細胞平衡，特別是哺乳動物對各種生理和病理的死亡信號的反應，如對感染源反應的調(diào)節(jié)起到非常關鍵的作用。在凋亡主要通路中，獲得或失去關鍵基因的功能，能夠引起細胞內(nèi)平衡紊亂，甚至引起疾病。有證據(jù)顯示不充分的細胞凋亡，能夠引起癌癥的發(fā)生或自身免疫病如急性或慢性退行性疾病，免疫缺陷性疾病等。按細胞凋亡過程中是否有絲氨酸激酶(C

2、aspase)參與，一般可以分為Caspase依賴的和Caspase非依賴的細胞凋亡；按引起凋亡信號發(fā)生的先后順序可以分為上游和下游信號通路。一般將源于線粒體的凋亡信號如細胞色素C的釋放引起的Caspase的級聯(lián)放大稱為下游凋亡信號，將傳至線粒體的信號稱為上游凋亡信號。目前對于凋亡發(fā)生的下游通路已相當清楚，但對于凋亡發(fā)生的上游信號還有待進一步闡明。為了研究細胞凋亡調(diào)控，發(fā)現(xiàn)凋亡相關基因，我們設計了一個功能基因鑒定程序用于Staurosp

3、orine(STS)和紫外線(UV)誘導細胞凋亡相關基因的發(fā)現(xiàn)。這一過程采用特定設計的逆轉錄病毒載體轉染細胞，使其隨機插入細胞基因組，根據(jù)表型挑選克隆，鑒定被破壞基因。我們用這種方法在神經(jīng)元細胞(SH-Sy5y)中發(fā)現(xiàn)凋亡相關基因RFP13。 細胞定位研究發(fā)現(xiàn)RFP13是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表達蛋白，RFP13的表達能夠引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的標志之一是c-JunN端激酶JNK活性的增加，JNK在調(diào)節(jié)促凋亡信號通路中起到關鍵作用。其引起細

4、胞凋亡的信號處于線粒體的上游，是細胞凋亡發(fā)生的上游信號。我們通過對RFP13全長蛋白生物信息學分析發(fā)現(xiàn)RFP13在N端(8-30aa)和中間(183-207aa)有兩段疏水內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜區(qū)，并通過構建不同缺失突變體轉染細胞表達得到證實。對各缺失突變體誘導細胞凋亡能力進行研究，發(fā)現(xiàn)它們誘導凋亡的能力依賴于ER定位和其C端，與各突變體激活JNK的能力相一致。 當RFP13表達引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激信號傳至下游的線粒體，引起線粒體外

5、膜通透性增高，導致下游凋亡促進分子如細胞色素C的釋放，在核苷酸dATP/ATP的存在下，細胞色素C與Apaf-1多聚化形成凋亡體(Apoptosome)，然后Apaf-1通過CARD結構域招募多個Caspase-9分子進入復合物，Caspase-9自身發(fā)生構象變化水解，從而引起下游的執(zhí)行Caspase，如Caspase-3的水解活化，Caspase-3活化后水解各種底物最終引起形態(tài)上可見的細胞凋亡，如細胞變圓、細胞核濃縮和破裂等。

6、 為了進一步證明RFP13誘導的細胞凋亡信號位于線粒體的上游，我們用RNA干擾(RNAi)技術使RFP13表達沉默。針對RFP13cDNA序列設計選擇了一段19nt的核苷酸，并將其克隆到穩(wěn)定表達載體pSilencerTM2.1-U6Hygro.同時在19nt上引入2個點突變作為對照siRNA。將RFP13siRNA與RFP13-cMyc共轉染，Western檢測發(fā)現(xiàn)RFP13siRNA能夠沉默RFP13的表達，并能抑制其引起的細胞凋亡