AMPK調(diào)控鈣內(nèi)流對(duì)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、隨著我國(guó)社會(huì)人口老齡化的加劇，老年人的健康問(wèn)題越來(lái)越受到關(guān)注。老年患者作為糖尿病的主體人群，糖尿病的心腦血管并發(fā)癥的發(fā)生是臨床上致死和致殘的重要原因，而動(dòng)脈粥樣硬化是糖尿病最常見(jiàn)的心腦血管并發(fā)癥。但其病因尚未完全闡明。內(nèi)皮細(xì)胞的過(guò)度凋亡是內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的重要表現(xiàn)形式，同時(shí)也是動(dòng)脈粥樣硬化形成的始動(dòng)因素。
　　有研究表明長(zhǎng)期高糖刺激，血管內(nèi)皮細(xì)胞的主要特征是在轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)下，產(chǎn)生一系列相關(guān)因子，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，引起糖尿病血管

2、并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。高糖在內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中起著重要作用，高糖誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，通過(guò)一系列復(fù)雜信號(hào)通路直接或間接引起血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。高糖引起內(nèi)皮凋亡的機(jī)制很多，如氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、鈣離子內(nèi)流。其中Ca2+濃度升高是其重要機(jī)制。鈣庫(kù)依賴性鈣通道(SOCC)在細(xì)胞凋亡增殖起著重要作用。但高糖對(duì)其具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。
　　AMPK是由α、β、γ三個(gè)亞基組成的異源三聚體，α亞基行使催化功能、β和γ亞基行使調(diào)節(jié)功能。α亞基有α1和α2

3、兩個(gè)亞型，在內(nèi)皮細(xì)胞中AMPKα1和α2均有表達(dá)，但以表達(dá)以α1亞單位為主。最近的證據(jù)表明AMPK在延緩動(dòng)脈粥樣硬化的形成和保護(hù)血管功能等過(guò)程中充當(dāng)重要的角色，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。
　　目的：
　　本研究以離體培養(yǎng)胰腺血管內(nèi)皮細(xì)胞(MS1)和構(gòu)建糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型為研究對(duì)象，采用激光共聚焦檢測(cè)鈣內(nèi)流、TUNEL檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡等方法，力圖證實(shí):1）、AMPK抑制高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡;2）、高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞

4、凋亡與鈣離子內(nèi)流相關(guān);3）、AMPK抑制高糖誘導(dǎo)的ROS生成;4）、AMPK抑制高糖介導(dǎo)的SOCC蛋白表達(dá)以及鈣離子內(nèi)流;5）、AMPK抑制動(dòng)脈粥樣斑塊形成。
　　方法:
　　1、采用離體培養(yǎng)MS1內(nèi)皮細(xì)胞株，應(yīng)用TUNEL法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。細(xì)胞分6組為:高糖組(30mM高糖刺激48h)、AMPK激動(dòng)劑組(1mMAICAR預(yù)處理2h)、高糖+ AICAR組(30mM高糖處理48h+1mMAICAR預(yù)處理2h)、SOC通道抑

5、制劑組(100uM2-APB預(yù)處理2h)和高糖+SOC通道抑制劑組(30mM高糖處理48h+100uM2-APB預(yù)處理2h)，另外設(shè)立對(duì)照組（未用任何處理因素）。
　　2、采用激光共聚焦檢測(cè)鈣離子內(nèi)流情況，將共聚焦培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞置于Hank液中，應(yīng)用特異性的熒光染料Fluo-3AM檢測(cè)內(nèi)鈣離子濃度。細(xì)胞分組為對(duì)照組、高糖組、AICAR組、高糖+AICAR組、SOC通道抑制劑(2-APB)和高糖+SOC通道抑制劑組。

6、　　3、采用DHE探針觀察細(xì)胞內(nèi)ROS形成，將內(nèi)皮細(xì)胞接種于六孔板中，細(xì)胞孵育DHE探針后于熒光顯微鏡下觀察ROS生成。細(xì)胞分組為對(duì)照組、高糖組、AICAR組、高糖+AICAR組。
　　4、采用Western Blotting技術(shù)檢測(cè)SOCC蛋白。內(nèi)皮細(xì)胞以105密度接種于六孔板中，每組三個(gè)副孔，細(xì)胞分組為對(duì)照組、高糖組、AICAR組、高糖+AICAR組，以1mMAICAR預(yù)處理2h，再給予高糖刺激48h。用PBS清洗細(xì)胞兩次后，

7、收集各組細(xì)胞，應(yīng)用WB技術(shù)檢測(cè)AMPK對(duì)SOC相關(guān)Stim1、Orai1蛋白表達(dá)的影響。
　　5、采用油紅O、HE染色觀察主動(dòng)脈斑塊形成。實(shí)驗(yàn)分組為普通飼料組、高脂組、STZ組、STZ組+對(duì)照病毒組、STZ組+AMPKα1過(guò)表達(dá)組，取小鼠胸主動(dòng)脈，縱向切開(kāi)后，采用油紅O染色觀察主動(dòng)脈血管內(nèi)斑塊形成，其余血管制成石蠟切片后，利用HE染色觀察AMPK對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化形成的影響。
　　結(jié)果：
　　1.高糖處理血管內(nèi)皮細(xì)胞后凋亡

8、明顯增多(P＜0.05)，而與高糖刺激組相比，預(yù)處理AMPK激動(dòng)劑能顯著抑制高糖刺激的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡(P＜0.05)
　　2.高糖刺激內(nèi)皮細(xì)胞后鈣離子內(nèi)流明顯增加，而給予2-APB預(yù)處理后，高糖介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和鈣內(nèi)流明顯能被SOC通道抑制劑抑制(P＜0.05)
　　3.高糖刺激內(nèi)皮細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)ROS生成增多，而給予AICAR預(yù)處理后，高糖誘導(dǎo)的ROS生成明顯能被AMPK激動(dòng)劑AICAR抑制(P＜0.05)
　　4.

9、高糖刺激內(nèi)皮細(xì)胞后，Stim1、Orai1蛋白表達(dá)增加，而與高糖組相比，高糖+AICAR組能夠明顯抑制Stim1、Orai1表達(dá)和鈣內(nèi)流(P＜0.05)
　　5.與高脂飼料組相比，小鼠給予STZ誘導(dǎo)糖尿病后，主動(dòng)脈粥樣斑塊形成明顯，而給予AMPKα1過(guò)表達(dá)慢病毒注射后，主動(dòng)脈斑塊形成明顯減少(P＜0.05)
　　結(jié)論：
　　1.高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，而AMPK能顯著抑制高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮凋亡。
　　2.高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮