用于狂犬病口服免疫的犬2型腺病毒重組載體的相關(guān)技術(shù)研究.pdf

1、狂犬病(Rabies)是由彈狀病毒科(Rahbdoviridae)狂犬病毒屬(Lyssavirus)中的狂犬病病毒（Rabies Virus，RABV）引起的一種以腦脊髓炎為主要特征的人獸共患傳染病?？袢∥：?yán)重，發(fā)病后死亡率幾乎為100％，目前尚無(wú)有效治療手段。本病在世界范圍內(nèi)均有流行，全球每年有約55000人死于狂犬病，大部分病例發(fā)生在人口密度較高、經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)的亞洲和非洲等發(fā)展中國(guó)家或地區(qū)。我國(guó)目前每年仍有狂犬病死亡病例約2000

2、人，曾一度位列法定報(bào)告?zhèn)魅静∈孜弧?br>　　動(dòng)物是狂犬病最主要的傳播宿主。在北美、西歐等發(fā)達(dá)國(guó)家，狂犬病的主要宿主為浣熊、狐貍、臭鼬、蝙蝠等野生動(dòng)物，在發(fā)展中國(guó)家，狂犬病主要在犬群中傳播和流行，發(fā)生外溢時(shí)，可能導(dǎo)致人或其他家畜感染。而在我國(guó)，非免疫的農(nóng)村家養(yǎng)犬和流浪犬、貓的大量存在是狂犬病得以不斷傳播并導(dǎo)致人發(fā)生狂犬病的根本原因，同時(shí)，鼬獾等野生動(dòng)物也是狂犬病傳播的重要宿主。
　　控制動(dòng)物狂犬病是防止狂犬病向人和其他家畜傳播的重

3、要措施，免疫預(yù)防則是控制動(dòng)物狂犬病的最有效手段。目前用于家養(yǎng)動(dòng)物狂犬病免疫的主要是滅活疫苗，部分國(guó)家同時(shí)采用弱毒活疫苗。上述兩類(lèi)疫苗只能通過(guò)注射免疫，對(duì)流浪犬、貓及野生動(dòng)物無(wú)法實(shí)施。因此，早在上個(gè)世紀(jì)60年代就有學(xué)者提出對(duì)這些動(dòng)物進(jìn)行口服免疫，并且在北美、西歐地區(qū)采用狂犬病病毒ERA株、SAG1株等弱毒疫苗、表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白的重組痘苗病毒及重組人5型腺病毒進(jìn)行大規(guī)模野外投放，有效遏制了狂犬病在野生動(dòng)物中的傳播和流行，甚至在部分地區(qū)消

4、除了狂犬病。但基于狂犬病弱毒株的口服疫苗，在使用中不斷發(fā)現(xiàn)其可導(dǎo)致零星狂犬病的發(fā)生，某些重組疫苗可引起暴露者發(fā)生載體病毒的感染，存在安全隱患;與此同時(shí)，這些適用于野生動(dòng)物的疫苗對(duì)犬的免疫效果不佳，因而迄今未能在流浪犬群中使用。研制更加安全、且適合犬尤其是流浪犬的口服狂犬病疫苗，對(duì)諸如我國(guó)和印度等國(guó)家的狂犬病防控具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　犬腺病毒(Canine Adenovirus，CAV)是腺病毒科的典型成員之一，分為兩型:犬Ⅰ型

5、腺病毒(CAV-1)及犬2型腺病毒(CAV-2)，前者為犬傳染性肝炎病毒，后者為犬傳染性喉氣管炎病毒，二者具有完全的交叉保護(hù)作用，目前臨床上常采用CAV-2的弱毒株作為疫苗，用于預(yù)防這兩種病毒的感染。同時(shí)， CAV-2具有可通過(guò)口腔感染的特性，其基因組的E3區(qū)為復(fù)制非必需區(qū)，部分或完全缺失后，不影響其增殖，可作為載體用于重組口服疫苗的構(gòu)建及目的抗原的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)室先后構(gòu)建了基于CAV-2的狂犬病重組疫苗，為盡早將其應(yīng)用于實(shí)際，本研究對(duì)本

6、病毒口服免疫的相關(guān)技術(shù)和應(yīng)用的可行性做了進(jìn)一步的探討。
　　基于以上，本研究開(kāi)展了以下試驗(yàn):
　　1.重組犬2型腺病毒口服食餌的研制。試驗(yàn)內(nèi)容:①口服疫苗食餌的制備:將106.875 TCID50/100μL的表達(dá)綠色熒光蛋白的重組犬2型腺病毒（CAV-2-EGFP）培養(yǎng)液與面粉、秘魯魚(yú)粉按照2∶2∶1的質(zhì)量比混合均勻，制成口服疫苗食餌，分成重量40g、直徑4cm大小的球狀，置入定制的網(wǎng)袋中;②口服食餌內(nèi)載體病毒的存活穩(wěn)定性

7、試驗(yàn):于不同環(huán)境（-20℃、室溫避光、室外）和不同時(shí)間(0、3、7、28天)后，用DMEM培養(yǎng)液等質(zhì)量稀釋食餌，經(jīng)10倍連續(xù)稀釋后，接種細(xì)胞，測(cè)定感染性病毒量;③載體病毒的免疫試驗(yàn):通過(guò)犬免疫試驗(yàn)，利用病毒中和抗體檢測(cè)方法進(jìn)行犬腺病毒中和抗體的測(cè)定。
　　2.犬群中犬腺病毒中和抗體的調(diào)查。試驗(yàn)內(nèi)容:①CAV-2-EGFP TCID50的滴定;②取自河北省、北京市、吉林省等城鄉(xiāng)犬只血清中犬腺病毒中和抗體的檢測(cè)和分析。
　　3.

8、狂犬病病毒BD06株糖蛋白-重組犬2型腺病毒基因組的構(gòu)建。試驗(yàn)內(nèi)容:①BD06株糖蛋白表達(dá)盒的構(gòu)建;②E3區(qū)缺失性中間載體pVAX-△E3-CGS的構(gòu)建;③重組犬2型腺病毒-狂犬病病毒糖蛋白重組基因組pPolyⅡ-CAV-2-CGS的獲得及鑒定。
　　通過(guò)以上試驗(yàn)，取得以下結(jié)果:
　　1.制成食餌后即刻測(cè)定的病毒含量為105.875 TCID50/100μL;-20℃貯存3、7、28天后，病毒量分別為105.875 TCID

9、50/100μL、105.875 TCID50/100μL、105.625TCID50/100μL;室溫避光下3、7、28天后，病毒量分別為105.625 TCID50/100μL、105.375 TCID50/100μL、103.5 TCID50/100μL;室外條件下3、7、28天后，病毒量分別為105 TCID50/100μL、104.125 TCID50/100μL、102.125 TCID50/100μL。免疫試驗(yàn)顯示犬體內(nèi)抗

10、CAV抗體低于1∶27時(shí)，經(jīng)一次口服免疫病毒量為105.875TCID50/100μL的口服疫苗后，抗CAV中和抗體均升高，抗體水平≥1∶243;犬免疫前抗CAV抗體過(guò)高(≥1∶2187)時(shí)，免疫后抗體水平則下降。
　　2.犬腺病毒中和抗體調(diào)查顯示，387份樣品中，河北省農(nóng)村犬血清147份，其中CAV中和抗體陽(yáng)性樣本27份，陽(yáng)性率為18％;北京市各區(qū)寵物醫(yī)院犬血清195份，其中CAV中和抗體陽(yáng)性樣本135份，陽(yáng)性率為69％;吉林省

11、農(nóng)村犬血清45份，其中CAV中和抗體陽(yáng)性樣本3份，陽(yáng)性率為7％，以上結(jié)果顯示，農(nóng)村犬只犬腺病毒感染率總體不超過(guò)20％，明顯低于城市犬。
　　3.利用AscⅠ、ClaⅠ、NruⅠ、SacⅠ限制性?xún)?nèi)切酶酶切鑒定重組基因組pPolyⅡ-CAV-2-CGS，目的條帶與理論計(jì)算值相同;所設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物分別能夠擴(kuò)增出1433bp和2227bp兩個(gè)片段，經(jīng)測(cè)序表明糖蛋白完整的表達(dá)盒已經(jīng)插入到缺失1041bp的E3區(qū)內(nèi)，即獲得重組質(zhì)粒pPolyⅡ

12、-CAV-2-CGS。
　　根據(jù)以上結(jié)果，得到下列結(jié)論:
　　1.制備了適合于投放和犬?dāng)z食的食餌，重組犬2型腺病毒在放置于室外環(huán)境的食餌中7天內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性，并確定犬腺病毒中和抗體低于1∶27時(shí)，經(jīng)單次免疫其中和抗體水平得到顯著提高，為該載體重組疫苗的應(yīng)用提供了關(guān)鍵數(shù)據(jù)。
　　2.河北省、吉林省農(nóng)村地區(qū)的犬群中犬腺病毒中和抗體平均陽(yáng)性率為16％，明顯低于北京城區(qū)犬只中的犬腺病毒中和抗體水平。說(shuō)明農(nóng)村地區(qū)犬腺病毒自然