白介素-7促進狂犬病病毒免疫記憶的作用機制研究.pdf

1、狂犬病(Rabies)作為最古老的傳染病之一，是由狂犬病病毒(Rabies Virus，RABV)引起的人獸共患中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳染病，分布于世界大部分地區(qū)。我國每年死于狂犬病的人數(shù)居世界第二位及全國各類傳染病死亡人數(shù)的前五位，其中95％以上的病例是因直接或間接接觸患病或帶毒的動物引發(fā)的。目前，狂犬病發(fā)病后的臨床治療仍是一個世界性難題，其致死率高達(dá)100％，尚無有效的治療手段。數(shù)據(jù)顯示，70％以上犬的免疫覆蓋率可以有效控制人間狂犬病，因此，

2、動物的免疫預(yù)防成為遏制人類狂犬病最為有效的措施。當(dāng)前用于動物狂犬病免疫的疫苗主要為安全的滅活疫苗，但價格昂貴，并需多次免疫才能獲得良好的長期保護，阻礙了其在發(fā)展中國家的廣泛應(yīng)用。因此，發(fā)展低毒、單劑量及長期有效的狂犬病疫苗對控制狂犬病具有重要意義。
　　近來研究表明，過表達(dá)樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DCs)刺激因子的重組狂犬病病毒可在淋巴結(jié)及外周血中招募并成熟DCs及B淋巴細(xì)胞，進而迅速產(chǎn)生顯著高水平的抗病毒中和

3、抗體(Virus-neutralizing antibodies，VNA)，但其有效持續(xù)時間短。當(dāng)前，尚未有研究通過應(yīng)用免疫記憶的作用機制來延長狂犬病疫苗誘導(dǎo)的體液免疫。本研究通過反向遺傳技術(shù)，在弱毒疫苗株rLBNSE的基礎(chǔ)上過表達(dá)對免疫細(xì)胞的生長、存活及分化方面具有廣泛效應(yīng)的白介素-7(Interleukin-7，IL-7)，并拯救獲得重組狂犬病病毒(rLBNSE-IL7)。在確定rLBNSE-IL7的體外生長特性不因外源基因IL-7

4、的插入而受到影響之后，通過ELISA檢測重組病毒感染細(xì)胞上清中IL-7的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)只有rLBNSE-IL7以劑量依賴形式表達(dá)IL-7，并對細(xì)胞無明顯副作用。將rLBNSE-IL7在BSR細(xì)胞中連續(xù)傳代10次，各代次均保持IL-7的穩(wěn)定遺傳。
　　為鑒定IL-7的表達(dá)對狂犬病病毒致病性的影響，將rLBNSE、rLBNSE-IL7以及陰性對照重組病毒rLBNSE-IL7(-)腦內(nèi)途徑感染免疫功能完全和不完全的小鼠。我們發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)高表達(dá)的

5、IL-7能夠限制病毒在腦內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，進一步減弱狂犬病病毒的致病力，而非IL-7的插入造成病毒基因組長度的增加所導(dǎo)致。
　　為進一步分析IL-7對狂犬病病毒免疫原性的作用，將重組病毒后肢肌肉途徑免疫小鼠，進行依賴T細(xì)胞的與B細(xì)胞相互作用的相關(guān)免疫機制研究。與親本病毒rLBNSE相比，重組病毒表達(dá)的IL-7可以顯著增加淋巴結(jié)中濾泡性T輔助細(xì)胞(Tfollicular helper cells，Tfh cells)、生發(fā)中心B細(xì)胞(

6、Germinal center cells，GC B cells)、長壽命記憶性B細(xì)胞(Memory B cells，Bmem)的數(shù)量和骨髓中長壽命漿細(xì)胞(Plasmacells，PCs)的比例。
　　由單劑量免疫rLBNSE-IL7所增殖的長壽命PCs可產(chǎn)生更加強大的免疫效力，維持顯著高水平的VNA和相關(guān)抗體亞類長達(dá)360天，且能夠長期有效保護絕大多數(shù)小鼠抵抗強毒株攻擊。此外，IL-7所增加的長壽命Bmem能夠于再次共同免疫rL

7、BNSE后，分化成抗體分泌細(xì)胞，迅速產(chǎn)生更高水平的VNA及相應(yīng)抗體亞類。上述結(jié)果表明IL-7促進了Tfh細(xì)胞的增殖，并在其協(xié)助下增強了GCs反應(yīng)，進一步生成與維持免疫記憶相關(guān)的長壽命Bmem和PCs，從而增強了機體針對狂犬病病毒的特異性初次免疫反應(yīng)和再次免疫應(yīng)答。
　　綜上所述，本研究成功構(gòu)建了表達(dá)IL-7的重組狂犬病病毒rLBNSE-IL7，鑒定了外源基因IL-7在病毒基因組中的表達(dá)不影響病毒的體外生長特性;且腦內(nèi)高表達(dá)的IL-