GeXP多重RT-PCR在疑似兒童肺炎支原體腦炎診斷中的敏感性研究.pdf

1、目的：肺炎支原體(mycoplasma pneumonia，MP)是引起小兒呼吸道感染的常見(jiàn)病原體之一。MP感染除引發(fā)呼吸系統(tǒng)炎癥外，還幾乎可以累及人體其他全部器官。神經(jīng)系統(tǒng)侵害是MP所導(dǎo)致肺外疾病中常見(jiàn)的類型之一。腦炎是MP感染累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表現(xiàn)中最為常見(jiàn)的一種[1]。目前，對(duì)于兒童罹患肺炎支原體腦炎(Mycoplasma pneumoniae encephalitis，MPIE)的診斷尚沒(méi)有明確標(biāo)準(zhǔn)，治療也有很多爭(zhēng)議。
　

2、　目前MP感染的檢測(cè)方法包括腦脊液(cerbrospinal fluid，CSF) PCR、腦脊液病原體的培養(yǎng)、血清特異性IgM和IgG抗體測(cè)定等方法。血清抗體檢測(cè)雖方便易行，但僅抗體陽(yáng)性不能確診，只能作為疑似病例。PCR和病原體培養(yǎng)可以作為確診MPIE的金標(biāo)準(zhǔn)，但兩種方法都存在著陽(yáng)性率極低的缺點(diǎn)。對(duì)于那些有腦炎癥狀而金標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)陰性的患者如何確診，是臨床診斷中的難題，急需找到敏感可行的檢測(cè)手段，提高檢出率，確定病因，輔助治療。
　

3、　由于實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段的日益成熟，傳統(tǒng)的PCR技術(shù)已經(jīng)無(wú)法滿足需求，由此而誕生的多重PCR(multiplex PCR)是在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中加上兩對(duì)或更多對(duì)的引物，并能同時(shí)擴(kuò)增出相應(yīng)多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)。而GeXP多重 RT-PCR(GeXP mRT-PCR)即為此原理。本研究預(yù)利用此方法診斷肺炎支原體腦炎，并與傳統(tǒng)的PCR法進(jìn)行比較，分析GeXP多重RT-PCR在診斷肺炎支原體腦炎中的敏感性。
　　方法：
　　1、資

4、料收集：2015年5月至2016年8月河北省兒童醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科病區(qū)收治的，初次入院的患兒100例(年齡32日-10歲，男女比例51:49)，以發(fā)熱伴頭痛為首發(fā)癥狀，有嗜睡，萎靡，嘔吐癥狀，后繼出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和體征的疑似腦炎的患兒，每位患兒在入院第一日或第二日采集1份腦脊液，1份靜脈血。
　　2、指標(biāo)檢測(cè)：對(duì)采集的100份疑似腦炎患者的腦脊液進(jìn)行病原體篩查。
　　(1)對(duì)所有標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)，培養(yǎng)陽(yáng)性的標(biāo)本可確診細(xì)菌

5、感染性腦炎。
　　(2)排除常見(jiàn)細(xì)菌性腦炎的剩余標(biāo)本進(jìn)行腦脊液抗酸染色檢查，抗酸陽(yáng)性的標(biāo)本可確診結(jié)核性腦膜炎。
　　(3)還未確診的標(biāo)本進(jìn)行腦脊液行普通涂片染色檢查，檢測(cè)新型隱球菌在內(nèi)的微生物，排除其他微生物感染所致腦炎。
　　(4)細(xì)菌檢測(cè)陰性的標(biāo)本進(jìn)行病毒學(xué)檢測(cè)：GeXP多重RT-PCR法設(shè)計(jì)有甲型流感病毒等多種病毒引物(見(jiàn)表-1)，排除病毒性腦炎的病例。同時(shí)亦進(jìn)行EBV血清IgM抗體檢測(cè)與腦脊液EBV DNA檢測(cè)

6、。
　　(5)對(duì)以上檢測(cè)全部陰性的標(biāo)本進(jìn)行支原體檢測(cè)。首先采用被動(dòng)顆粒凝集法進(jìn)行血清中的肺炎支原體IgM檢測(cè)，篩查出血清抗體陽(yáng)性的疑似支原體腦炎患者，再對(duì)該病人的腦脊液分別采用GeXP多重RT-PCR和普通PCR法檢測(cè)，并對(duì)比分析檢測(cè)結(jié)果，探尋檢測(cè)支原體感染性腦炎的敏感方法。
　　(6)對(duì)所有標(biāo)本進(jìn)行腦脊液生化檢查(項(xiàng)目包括腦脊液葡萄糖含量測(cè)定、腦脊液蛋白含量測(cè)定、腦脊液氯離子含量測(cè)定、腦脊液腺苷脫氨酶測(cè)定，其中葡萄糖和蛋白

7、質(zhì)含量作為主要參考指標(biāo))、腦脊液細(xì)胞學(xué)常規(guī)檢查，綜合上述檢測(cè)結(jié)果，作出最后的病原學(xué)診斷。
　　(7)最后測(cè)定的肺炎支原體陽(yáng)性標(biāo)本，進(jìn)一步DNA測(cè)序鑒定。
　　3、分析的指標(biāo):(1)GeXP多重RT-PCR檢測(cè)法：標(biāo)本最終經(jīng)過(guò)毛細(xì)管電泳呈現(xiàn)圖形顯示，肺炎支原體陽(yáng)性結(jié)果中除3個(gè)內(nèi)參峰，在核酸片段大小為216.8nt處出現(xiàn)特異的MP陽(yáng)性峰。
　　(2)抗體顆粒凝集法結(jié)果顯示為(+++)時(shí)為陽(yáng)性，顯示(-)，(+)，(++)時(shí)

8、均為陰性。
　　(3)對(duì)兩方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合患者各項(xiàng)臨床指標(biāo)和腦脊液實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，最后確診是否為肺炎支原體腦炎，并比較檢出率差異。
　　4、統(tǒng)計(jì)分析：采用配對(duì)資料χ2檢驗(yàn)查驗(yàn)陽(yáng)性率有無(wú)差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果：
　　1、細(xì)菌學(xué)檢測(cè)結(jié)果：大腸埃希菌陽(yáng)性1例，肺炎克雷伯菌陽(yáng)性1例，金黃色葡萄球菌陽(yáng)性2例，表皮葡萄球菌陽(yáng)性1例，人葡萄球菌陽(yáng)性2例，肺炎鏈球菌陽(yáng)性7例，結(jié)核分支桿菌陽(yáng)性4例，白色念珠菌陽(yáng)性2

9、例(見(jiàn)表-2)。細(xì)菌性腦炎合計(jì)18例，真菌性腦炎2例。
　　2、病毒學(xué)檢測(cè)結(jié)果：排除上述病原體檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本20例后，尚未確診的80例標(biāo)本進(jìn)行EBV檢測(cè)：結(jié)果顯示EBV IgM抗體和腦脊液EBV DNA均為陽(yáng)性的標(biāo)本共2例(見(jiàn)表-3)。
　　3、經(jīng)上述檢測(cè)后，尚剩余78例標(biāo)本未確診，進(jìn)行支原體檢測(cè)：采集的血清經(jīng)抗體顆粒凝集法檢測(cè)，19例血清支原體IgM陽(yáng)性，視為可疑支原體腦炎病例。隨后將19例可疑腦脊液標(biāo)本經(jīng)GeXP多重RT-

10、PCR分析系統(tǒng)檢測(cè)，得到8例陽(yáng)性標(biāo)本，陽(yáng)性率為42％。而普通PCR法僅測(cè)出2例陽(yáng)性結(jié)果。經(jīng)x2檢驗(yàn)，P<0.05，兩種檢測(cè)結(jié)果存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，GeXP多重RT-PCR法優(yōu)于普通PCR法(見(jiàn)表-4)。
　　4、最后檢測(cè)得到的8例陽(yáng)性標(biāo)本，由于兩種PCR結(jié)果不一致，故而將PCR產(chǎn)物送生物公司測(cè)序檢測(cè)，結(jié)果證明這8例均為肺炎支原體陽(yáng)性結(jié)果(見(jiàn)附圖2)。
　　結(jié)論：
　　1、 GeXP多重RT-PCR法在檢測(cè)腦脊液肺炎支原體時(shí)