富氫液對(duì)Heymann腎炎大鼠腎臟Nrf2-HO-1信號(hào)通路及TGF-β1、IV型膠原表達(dá)的影響.pdf

1、目的：Heymann腎炎是人類特發(fā)性膜性腎病（idiopathic membranous nephropathy，IMN）的經(jīng)典動(dòng)物腎炎模型，具有人類特發(fā)性膜性腎病的臨床及病理特點(diǎn)。近些年的研究結(jié)果顯示 Heymann腎炎發(fā)病機(jī)制涉及補(bǔ)體活化、氧化反應(yīng)、細(xì)胞因子激活、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬等個(gè)多方面。在Heymann腎炎發(fā)病過程中，補(bǔ)體活化后產(chǎn)生膜攻擊復(fù)合物C5b-9，可誘導(dǎo)生成大量的活性氧。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，活性氧的堆積可激活Nrf2/HO

2、-1信號(hào)通路，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，從而阻止脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的發(fā)生。此外，在Heymann腎炎后期，主要的病理改變是IV型膠原、纖維連接蛋白和層粘連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）成分增多堆積。研究證實(shí)轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）可以促進(jìn)ECM的形成，在腎小球硬化及纖維化機(jī)制中占有重要地位。這樣，氧化反應(yīng)與炎癥因子協(xié)調(diào)作用，共同導(dǎo)致了腎臟組織

3、病變。探索新型的治療方法，阻斷或抑制氧化和炎癥反應(yīng)，延緩腎功能損害，一直都是腎臟病領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。早些年，國內(nèi)外學(xué)者一直認(rèn)為氫氣屬于生理性惰性氣體。隨著研究的深入，越來越多的證據(jù)顯示氫氣具有選擇性抗氧化、抗炎及抗凋亡的作用，但與腎臟病相關(guān)的研究報(bào)道甚少。
　　本課題擬通過建立主動(dòng)型Heymann腎炎（Active Heymann Nephritis，AHN）大鼠模型，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色、實(shí)時(shí)定量PCR等方法檢測(cè)腎臟組織中Nrf2

4、、HO-1及TGF-β1、IV型膠原的表達(dá)情況。并給予富氫液（15mg/Kg）進(jìn)行干預(yù)，觀察AHN大鼠腎臟組織內(nèi)各指標(biāo)的表達(dá)狀況，探討富氫液對(duì)其干預(yù)作用及機(jī)制，為人類IMN的預(yù)防和治療提供新的思路。
　　方法：選擇SD大鼠（健康清潔級(jí)，雄性）36只，體重約200±20g，隨機(jī)分為正常對(duì)照（NC組，n=12）、Heymann腎炎模型組（HN組，n=12）、富氫液干預(yù)組（HRS組，n=12）。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，給予HN組、HRS組大鼠

5、腹腔注射免疫原2ml/只(含腎皮質(zhì)0.5g)，制備 Heymann腎炎大鼠模型；NC組大鼠給予腹腔注射佐劑對(duì)照2ml/只，作為正常對(duì)照；腹腔注射方式均為每兩周一次，共6次。自注射免疫原第一次起，HRS組大鼠每日給予（濃度0.8mmol/L）富氫液15ml/kg灌胃，NC組、HN組則每日給予等量的生理鹽水灌胃。實(shí)驗(yàn)期間，所有大鼠均飼養(yǎng)于溫度（20℃-26℃）且濕度（45％-70%）的相對(duì)恒定的環(huán)境中，自由進(jìn)食水。于4周末、8周末，將大鼠置

6、于清潔代謝籠內(nèi)，留取24小時(shí)尿并測(cè)定24小時(shí)尿蛋白定量。大鼠在注射免疫原后4周末，高于正常大鼠24小時(shí)尿蛋白定量則為腎炎形成的標(biāo)志。至第一次注射免疫原后12周末、14周末，每組隨機(jī)選取6只大鼠，測(cè)定24小時(shí)尿蛋白定量、血肌酐、血尿素氮。并收集大鼠腎組織標(biāo)本，制備病理組織切片，以備蘇木素-伊紅（HE）染色、糖原（PAS）染色及免疫組織化學(xué)染色，觀察大鼠腎組織病理變化；免疫組織化學(xué)及實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)Nrf2、HO-1及TGF-β1、I

7、V型膠原的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±S）表示，應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，滿足正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，不滿足正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)資料采用非參數(shù)檢驗(yàn)分析，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.一般情況
　　NC組大鼠飲食正常，毛發(fā)光亮柔順，生長發(fā)育良好。HN組、HRS組大鼠腹腔注射免疫原后逐漸出現(xiàn)飲食減少，反應(yīng)遲鈍，毛發(fā)無光，部分大鼠出現(xiàn)腹水。其中

8、HRS大鼠較HN組大鼠情況稍好。
　　2.生化指標(biāo)
　　2.1 24小時(shí)尿蛋白定量
　　與同期NC組相比，所有時(shí)間點(diǎn)中，HN組、HRS組大鼠24小時(shí)尿蛋白水平均升高（P＜0.05）。其中，與HN組相比，4周末，HRS組大鼠24小時(shí)尿蛋白水平無明顯變化（P＞0.05）；8周末、12周末、14周末，HRS組大鼠24小時(shí)尿蛋白水平顯著下降（P＜0.05）。
　　2.2 血肌酐、血尿素氮
　　與同期NC組相比，12

9、周末、14周末，HN組、HRS組大鼠血肌酐、血尿素氮水平升高（P＜0.05）。與HN組相比，12周末，HRS組血肌酐水平未見明顯變化（P＞0.05），而血尿素氮水平出現(xiàn)下降（P＜0.05）；14周末，HRS組血肌酐、血尿素氮水平均出現(xiàn)明顯下降（P＜0.05）。
　　3.腎臟組織變化
　　光鏡下顯示，NC組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常，基底膜均勻一致，無增厚，無系膜細(xì)胞、系膜基質(zhì)增多等異常改變。與NC組相比，HN組和HRS大鼠腎小球基底

10、膜呈不同程度增厚,內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)腫脹;腎小管結(jié)構(gòu)紊亂,間質(zhì)內(nèi)有局灶性淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤。且HN組較HRS組腎臟組織病變更加嚴(yán)重，14周末較12周末病理改變更明顯。
　　4.免疫組織化學(xué)檢測(cè)
　　與同期NC組相比，12周末、14周末時(shí)，HRS組、HN組Nrf2、HO-1、TGF-β1、IV型膠原表達(dá)均增多（P＜0.05）；與同期HN組相比，HRS組TGF-β1、IV型膠原表達(dá)水平下降（P＜0.05），Nrf2、HO-1表達(dá)有所

11、增多（P＜0.05）。
　　5.實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)
　　與同期NC組相比，12周末、14周末時(shí)，HRS組、HN組Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA、TGF-β1 mRNA、IV型膠原mRNA表達(dá)均增多（P＜0.05）；與同期HN組相比，HRS組TGF-β1 mRNA、IV型膠原mRNA表達(dá)水平不同程度下降（P＜0.05），而Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA表達(dá)有所增多（P＜0.05）。
　　結(jié)論：