Herpesvirus Entry Mediator-CD160介導人調節(jié)性T細胞對CD4+效應性T細胞的抑制作用.pdf

1、研究背景：器官移植現(xiàn)已作為治療器官功能衰竭的有效措施，然而器官移植后各種類型的移植物排斥反應仍然是器官移植的主要障礙之一。移植排斥反應的始動環(huán)節(jié)是機體針對同種異體抗原的T細胞活化與增殖，而協(xié)同刺激信號系統(tǒng)是T細胞活化的必要條件。隨著研究的深入人們發(fā)現(xiàn)：協(xié)同刺激信號系統(tǒng)內，除存在一類能刺激細胞活化的共刺激分子外，還存在另外一類抑制細胞活化的共抑制分子?，F(xiàn)已有多種動物移植模型及臨床研究顯示：阻斷或者激活某條協(xié)同刺激通路后可明顯抑制效應性T細

2、胞活化增殖，減少各種移植排斥反應，延長移植物生存時間。HVEM(Herpesvirus EntryMediator)/CD160為近年來新發(fā)現(xiàn)的共抑制分子配/受體，研究發(fā)現(xiàn)激活小鼠CD4+T細胞HVEM/CD160通路能顯著抑制小鼠CD4+效應性T細胞(Effective T cells，Teffs)的活化增殖及IL-2等細胞因子的產生，從而延長移植心臟的存活時間。CD4+CD25+調節(jié)性T細胞(Regulatory T cells，T

3、regs)作為一群特殊的T細胞亞群，具有抑制效應性T細胞活化、增殖及細胞因子產生的作用，從而參與機體免疫調節(jié)。同時，CD4+CD25+調節(jié)性T細胞表面也有大量協(xié)同刺激分子的表達。這些協(xié)同刺激分子對于Treg的發(fā)育、成熟以及免疫抑制功能密切相關。有研究認為Treg 可能通過這些協(xié)同刺激分子而抑制效應性T細胞活化、增殖及細胞因子的產生。Cai等的研究發(fā)現(xiàn)小鼠CD4+CD25+調節(jié)性T細胞表面高表達HVEM分子。在敲除HVEM基因后， CD4

4、+CD25+Treg的上述免疫抑制作用明顯減弱。上述研究提示Treg 可能通過HVEM/CD160介導了對Teffs的免疫抑制作用。另有研究發(fā)現(xiàn)人CD4+T細胞表面也有HVEM、CD160表達，然而它們在CD4+CD25+Tregs及CD4+CD25—Teffs的具體表達情況，以及它們對調節(jié)性T細胞免疫抑制功能的影響并未深入研究。
　　 目的:
　　 本實驗通過免疫磁珠分選法分選高純度人CD4+CD25+Tregs及CD

5、4+CD25—Teffs，并研究HVEM、CD160在不同CD4+T細胞亞群、不同功能狀態(tài)下的表達；同時研究HVEM/CD160通路對CD4+CD25+調節(jié)性T細胞功能基因Foxp3的表達及其免疫調節(jié)作用的影響。
　　 方法:
　　 1.CD4+CD25+Tregs及CD4+CD25-Teffs的分選及分選純度鑒定：
　　 采用濃度梯度離心法，從濃縮白細胞(白膜)中提取外周血單個核細胞(PBMC)。將提取的PBM

6、C 懸液按CD4+CD25+Regulatory T cell Isolation Kit 說明，進行一次CD4+T細胞的陽性分選及兩次CD25+Tregs的陰性分選，得到CD4+CD25+Tregs及CD4+CD25-Teffs。分選的CD4+CD25+Tregs 經破膜處理后，行胞內Foxp3 染色及CD4、CD25表面分子染色。最后通過流式細胞分析技術分析免疫磁珠分選的CD4+CD25+Tregs的純度。
　　 2.流式細

7、胞術檢測CD4+CD25+Tregs及CD4+CD25-Teffs不同功能狀態(tài)下HVEM/CD160表達：
　　 將免疫磁珠法分選的CD4+CD25+Tregs及CD4+CD25-T細胞分別培養(yǎng)于U 型底96孔培養(yǎng)板內，同時加入與細胞數(shù)量相等的Dynabeads Huamn T-Activator CD3/CD28磁珠，及300單位/mL濃度的人重組IL-2作為刺激因素。于培養(yǎng)刺激第0天、3天、5天三個時間點分別對CD4+CD2

8、5+Tregs細胞的HVEM及CD4+CD25-T細胞的CD160進行胞外染色，通過流式細胞分析技術分析兩種分子在各自細胞表面的表達情況。
　　 3.RT-PCR 檢測Treg Foxp3表達：
　　 采用HSV1gD蛋白阻斷CD4+CD25+Tregs HVEM/CD160后，通過RT-PCR 技術檢測其Foxp3基因的表達情況。
　　 4.3H-TdR 摻入法檢測CD4+CD25+Tregs細胞免疫抑制功能：

9、
　　 分選的CD4+CD25+Tregs 經不同濃度梯度的HSV1gD蛋白阻斷HVEM/CD160處理后，與等量CD4+CD25-Teffs 混合共培養(yǎng)，然后行3H-TdR 摻入法檢測共培養(yǎng)體系的增殖效率：CPM值。
　　 結果:
　　 1.采用免疫磁珠分選法分選的CD4+CD25+Treg細胞得率較高，分選細胞存活率為：95.65±1.92％，細胞活力好。通過流式細胞分析技術對其純度進行鑒定：CD4、CD25

10、分子雙陽性細胞占分選細胞總數(shù)的91.23％；而CD4、CD25、Foxp3 三陽性細胞，即是CD4+CD25+Foxp3+Treg 占分選細胞總數(shù)的70.55％。
　　 2.HVEM在初始Treg呈中度表達，且隨著Treg的活化，其表面HVEM分子表達率上調，與活化前比較差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)；其配體CD160分子在初始CD4+CD25-T細胞呈低表達狀態(tài)，且隨著CD4+CD25-T細胞的活化其表達CD160升高，與

11、活化前比較差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　 3．實時熒光定量PCR 結果顯示：經HSV1gD蛋白阻斷HVEM—CD160通路后Treg的Foxp3基因表達率降低，與空白對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)。
　　 4.3H-TdR 摻入實驗結果顯示：免疫磁珠分選的CD4+CD25+Treg 經不同濃度的gD蛋白處理，阻斷HVEM—CD160通路后其免疫抑制作用明顯降低，處理組細胞增殖明顯高于空白對照組

12、，差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)，且細胞增殖程度呈濃度依賴性升高。
　　 結論:
　　 1.HVEM分子表達于Treg表面，而其配體CD160分子表達于Teff。隨著兩種細胞的活化，兩種分子各自表達上調。
　　 2.Treg表面表達的HVEM分子與Teff表達的CD160結合后可上調Treg Foxp3基因的表達。
　　 3.Treg通過表達的HVEM作用于表達CD160的Teff。其可能作為Treg