Herpesvirus Entry Mediator-CD160介導(dǎo)人調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)CD4+效應(yīng)性T細(xì)胞的抑制作用.pdf

1、研究背景：器官移植現(xiàn)已作為治療器官功能衰竭的有效措施，然而器官移植后各種類(lèi)型的移植物排斥反應(yīng)仍然是器官移植的主要障礙之一。移植排斥反應(yīng)的始動(dòng)環(huán)節(jié)是機(jī)體針對(duì)同種異體抗原的T細(xì)胞活化與增殖，而協(xié)同刺激信號(hào)系統(tǒng)是T細(xì)胞活化的必要條件。隨著研究的深入人們發(fā)現(xiàn)：協(xié)同刺激信號(hào)系統(tǒng)內(nèi)，除存在一類(lèi)能刺激細(xì)胞活化的共刺激分子外，還存在另外一類(lèi)抑制細(xì)胞活化的共抑制分子?，F(xiàn)已有多種動(dòng)物移植模型及臨床研究顯示：阻斷或者激活某條協(xié)同刺激通路后可明顯抑制效應(yīng)性T細(xì)

2、胞活化增殖，減少各種移植排斥反應(yīng)，延長(zhǎng)移植物生存時(shí)間。HVEM(Herpesvirus EntryMediator)/CD160為近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的共抑制分子配/受體，研究發(fā)現(xiàn)激活小鼠CD4+T細(xì)胞HVEM/CD160通路能顯著抑制小鼠CD4+效應(yīng)性T細(xì)胞(Effective T cells，Teffs)的活化增殖及IL-2等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而延長(zhǎng)移植心臟的存活時(shí)間。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells，T

3、regs)作為一群特殊的T細(xì)胞亞群，具有抑制效應(yīng)性T細(xì)胞活化、增殖及細(xì)胞因子產(chǎn)生的作用，從而參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)。同時(shí)，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面也有大量協(xié)同刺激分子的表達(dá)。這些協(xié)同刺激分子對(duì)于Treg的發(fā)育、成熟以及免疫抑制功能密切相關(guān)。有研究認(rèn)為T(mén)reg 可能通過(guò)這些協(xié)同刺激分子而抑制效應(yīng)性T細(xì)胞活化、增殖及細(xì)胞因子的產(chǎn)生。Cai等的研究發(fā)現(xiàn)小鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面高表達(dá)HVEM分子。在敲除HVEM基因后， CD4

4、+CD25+Treg的上述免疫抑制作用明顯減弱。上述研究提示Treg 可能通過(guò)HVEM/CD160介導(dǎo)了對(duì)Teffs的免疫抑制作用。另有研究發(fā)現(xiàn)人CD4+T細(xì)胞表面也有HVEM、CD160表達(dá)，然而它們?cè)贑D4+CD25+Tregs及CD4+CD25—Teffs的具體表達(dá)情況，以及它們對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞免疫抑制功能的影響并未深入研究。
　　 目的:
　　 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫磁珠分選法分選高純度人CD4+CD25+Tregs及CD

5、4+CD25—Teffs，并研究HVEM、CD160在不同CD4+T細(xì)胞亞群、不同功能狀態(tài)下的表達(dá)；同時(shí)研究HVEM/CD160通路對(duì)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能基因Foxp3的表達(dá)及其免疫調(diào)節(jié)作用的影響。
　　 方法:
　　 1.CD4+CD25+Tregs及CD4+CD25-Teffs的分選及分選純度鑒定：
　　 采用濃度梯度離心法，從濃縮白細(xì)胞(白膜)中提取外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。將提取的PBM

6、C 懸液按CD4+CD25+Regulatory T cell Isolation Kit 說(shuō)明，進(jìn)行一次CD4+T細(xì)胞的陽(yáng)性分選及兩次CD25+Tregs的陰性分選，得到CD4+CD25+Tregs及CD4+CD25-Teffs。分選的CD4+CD25+Tregs 經(jīng)破膜處理后，行胞內(nèi)Foxp3 染色及CD4、CD25表面分子染色。最后通過(guò)流式細(xì)胞分析技術(shù)分析免疫磁珠分選的CD4+CD25+Tregs的純度。
　　 2.流式細(xì)

7、胞術(shù)檢測(cè)CD4+CD25+Tregs及CD4+CD25-Teffs不同功能狀態(tài)下HVEM/CD160表達(dá)：
　　 將免疫磁珠法分選的CD4+CD25+Tregs及CD4+CD25-T細(xì)胞分別培養(yǎng)于U 型底96孔培養(yǎng)板內(nèi)，同時(shí)加入與細(xì)胞數(shù)量相等的Dynabeads Huamn T-Activator CD3/CD28磁珠，及300單位/mL濃度的人重組IL-2作為刺激因素。于培養(yǎng)刺激第0天、3天、5天三個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別對(duì)CD4+CD2

8、5+Tregs細(xì)胞的HVEM及CD4+CD25-T細(xì)胞的CD160進(jìn)行胞外染色，通過(guò)流式細(xì)胞分析技術(shù)分析兩種分子在各自細(xì)胞表面的表達(dá)情況。
　　 3.RT-PCR 檢測(cè)Treg Foxp3表達(dá)：
　　 采用HSV1gD蛋白阻斷CD4+CD25+Tregs HVEM/CD160后，通過(guò)RT-PCR 技術(shù)檢測(cè)其Foxp3基因的表達(dá)情況。
　　 4.3H-TdR 摻入法檢測(cè)CD4+CD25+Tregs細(xì)胞免疫抑制功能：

9、
　　 分選的CD4+CD25+Tregs 經(jīng)不同濃度梯度的HSV1gD蛋白阻斷HVEM/CD160處理后，與等量CD4+CD25-Teffs 混合共培養(yǎng)，然后行3H-TdR 摻入法檢測(cè)共培養(yǎng)體系的增殖效率：CPM值。
　　 結(jié)果:
　　 1.采用免疫磁珠分選法分選的CD4+CD25+Treg細(xì)胞得率較高，分選細(xì)胞存活率為：95.65±1.92％，細(xì)胞活力好。通過(guò)流式細(xì)胞分析技術(shù)對(duì)其純度進(jìn)行鑒定：CD4、CD25

10、分子雙陽(yáng)性細(xì)胞占分選細(xì)胞總數(shù)的91.23％；而CD4、CD25、Foxp3 三陽(yáng)性細(xì)胞，即是CD4+CD25+Foxp3+Treg 占分選細(xì)胞總數(shù)的70.55％。
　　 2.HVEM在初始Treg呈中度表達(dá)，且隨著Treg的活化，其表面HVEM分子表達(dá)率上調(diào)，與活化前比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)；其配體CD160分子在初始CD4+CD25-T細(xì)胞呈低表達(dá)狀態(tài)，且隨著CD4+CD25-T細(xì)胞的活化其表達(dá)CD160升高，與

11、活化前比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　 3．實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果顯示：經(jīng)HSV1gD蛋白阻斷HVEM—CD160通路后Treg的Foxp3基因表達(dá)率降低，與空白對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。
　　 4.3H-TdR 摻入實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：免疫磁珠分選的CD4+CD25+Treg 經(jīng)不同濃度的gD蛋白處理，阻斷HVEM—CD160通路后其免疫抑制作用明顯降低，處理組細(xì)胞增殖明顯高于空白對(duì)照組

12、，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，且細(xì)胞增殖程度呈濃度依賴性升高。
　　 結(jié)論:
　　 1.HVEM分子表達(dá)于Treg表面，而其配體CD160分子表達(dá)于Teff。隨著兩種細(xì)胞的活化，兩種分子各自表達(dá)上調(diào)。
　　 2.Treg表面表達(dá)的HVEM分子與Teff表達(dá)的CD160結(jié)合后可上調(diào)Treg Foxp3基因的表達(dá)。
　　 3.Treg通過(guò)表達(dá)的HVEM作用于表達(dá)CD160的Teff。其可能作為T(mén)reg