人CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞及其在兒童急性白血病中的研究.pdf

1、人類天然CD4<'+>CD25<'+>調(diào)節(jié)性T細胞(nTreg)起源于胸腺，由遺傳控制，受抗原識別和多種信號的影響，尤其是細胞因子如IL-2、TGF-B等控制著它們的活化、擴增和抑制功能。其發(fā)育可能經(jīng)歷了兩個連續(xù)的過程，即在胸腺中啟動調(diào)節(jié)表型，獲得抑制活性，在外周的淋巴器官進一步活化。人nTreg細胞約占外周血CD4<'+>細胞的5-10％，除組成性地表達IL-2受體α鏈(CD25)和CTIA-4(CD152)外，還表達GITR、CD6

2、2L 等。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，forkhead box p3基因編碼的一種核蛋白——FoxP3調(diào)控著CD4<'+>CD25<'+>T細胞的發(fā)育和抑制功能，是Treg細胞更為特異的標記物。 Treg具有免疫無能性和免疫抑制性兩大特點，即在各種刺激下不發(fā)生增殖，也不分泌IL-2、IFN-γ，但經(jīng)TCR激活后，能夠抑制CD4<'+>CD25<'->效應性T細胞(T-resp)和CD8<'+>T細胞的增殖及其細胞因子的產(chǎn)生，抑制T-resp

3、、細胞毒性T淋巴細胞(CTL)和自然殺傷細胞(NK)的抗腫瘤免疫反應，因此Treg細胞在介導對自身抗原的耐受、抗移植排斥反應和抑制腫瘤的免疫應答中發(fā)揮著重要的作用。 目的 (1)探討人CD4<'+>CD25<'+>調(diào)節(jié)性T細胞的檢測條件、方法，建立不同年齡正常人群的參考值范圍，分析其分布規(guī)律；(2)檢測臍血和新生兒外周血CD4<'+>CD25<'+>T細胞的表型特征，探討其在母體內(nèi)和臍血干細胞移植中發(fā)揮的作用；(3)體

4、外分離CD4<'+>CD25<'+>T細胞，檢測其表型特征，并進行體外擴增實驗和功能測定。(4)檢測不同治療階段急性淋巴細胞性白血病患兒外周血的Treg，探討其在兒童ALL發(fā)生、治療過程中所處的地位和意義。 方法 (1)采用雙色或三色直接免疫熒光素法標記細胞抗原，包括細胞膜表面、胞漿和胞核抗原，如：CD4、CD25、CD62L、CD45RA、CD45RO、CDl52、FoxP3等，多參數(shù)流式細胞術(shù)檢測；(2)應用MACS

5、和FACS分選CD4<'+>CD25<'+>、CD4<'+>CD25<'->T細胞，F(xiàn)ACS測定細胞純度；(3)分別培養(yǎng)分選純化后的淋巴細胞，觀察CD4<'+>CD25<'+>T細胞在抗CD3單抗、抗CD28單抗的刺激并有高濃度IL-2存在的情況下能否增殖；(4)進行混合淋巴細胞培養(yǎng)，比色法測定CD4<'+>CD25<'+>T細胞的抑制功能。 結(jié)果 (1)標本分別在室溫下放置0h、1h、2h、3h、4h、5h和6h檢測時

6、，CD4<'+>CD25<'hi>T細胞分別為(1.41±0.26)％、(1.45±0.26)％、(1.32±0.26)％、(1.27±0.28)％、(1.09±0.24)％、(0.95±0.18)％、(0.91±0.21)％。結(jié)合細胞分布特點，將CD25的MFI約是CD4<'+>CD25<'+>細胞2倍的亞細胞群定為CD4<'+>CD25<'hi>T細胞，85％以上的CD4<'+>CD25<'hi>表達FoxP3。(2)4-6歲組、7

7、-14歲組、20-59歲組、60歲以上組健康人群CD4<'+>CD25<'hi>參考值分別是(0.92±0.30)％、(1.21±0.45)％、(1.44±0.52)％及(1.5 1±0.55)％。(3)臍血及新生兒外周血CD4<'+>CD25<'+>T細胞呈熒光強度比較均勻一致的獨立細胞群，且以CD45RA+亞型為主，成人的Treg則主要是CD45RO+細胞。(4)經(jīng)300U/mL的IL-2和抗CD3、抗CD28單抗刺激后12天，Tr

8、eg細胞數(shù)量擴增了約1300倍；在混合淋巴細胞培養(yǎng)中，新鮮分選的CD4<'+>CD25<'+>T細胞可抑制約50％的CD4<'+>CD25<'->T細胞增殖。(5)標危組治療不同階段的ALL兒童CD4<'+>CD25<'hi>數(shù)值分別為：首次誘導完全緩解組(1.04±0.33)％，3年以上持續(xù)完全緩解組(1.29±0.30)％，維持治療組(1.60±0.44)％；中/高危維持治療組為(2.24±0.75)％。 結(jié)論 (1

9、)明確了檢測人Treg的最佳條件(即標本應在3h內(nèi)檢測)和分析方法，通過FoxP3表達特征及功能實驗證明CD4<'+>CD25<'hi>更能特異性代表和反應Treg細胞的水平。(2)建立不同年齡段正常人CD4<'+>CD25h<'hi>T細胞的參考值范圍，并發(fā)現(xiàn)隨年齡變化人Treg也呈現(xiàn)規(guī)律性改變。(3)臍血及新生兒外周血CD4<'+>CD25<'+>T細胞有獨特的表型特征，數(shù)量較高且功能完好。(4)在特定的培養(yǎng)條件下，Treg細胞可以