脈沖剪切力對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞ACE2的表達(dá)調(diào)節(jié)及分子機(jī)制研究.pdf

1、本文分為以下兩個(gè)部分進(jìn)行探討：
　?、?ACE2在脈沖剪切力調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)功能中的作用
　　目的：
　　1.在體外細(xì)胞水平，明確脈沖剪切力對(duì)血管內(nèi)皮ACE2表達(dá)的影響。
　　2.在體外細(xì)胞水平，明確ACE2在脈沖剪切力調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能中的作用。
　　3.在整體動(dòng)物水平，觀察剪切力對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞ACE2表達(dá)的影響。
　　方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)
　　嚴(yán)格無菌條件下獲得新生兒臍帶，采用

2、胰酶消化法得到原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)，用含20％胎牛血清的M199培養(yǎng)基在37℃、5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，傳代后改用含10％胎牛血清的M199培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并利用細(xì)胞免疫熒光法進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞鑒定，實(shí)驗(yàn)選取4-8代內(nèi)皮細(xì)胞。
　　2.剪切力干預(yù)
　　將HUVECs接種至鋪有Ⅰ型鼠尾膠原的載玻片上，在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至90％時(shí)，利用Flexcell剪切力儀分別給予細(xì)胞脈沖剪切力(PSS，12±4

3、dyn/cm2,1Hz)和震蕩剪切力（OSS，0±4 dyne/cm2,1Hz）刺激不同的時(shí)間(0、1、3、6、12、18小時(shí))，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后收集細(xì)胞，利用qRT-PCR和Western blot檢測(cè)ACE2的mRNA及蛋白水平，明確不同形式的剪切力對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞ACE2表達(dá)的影響的時(shí)間趨勢(shì)。
　　3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)
　　采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，使用TAKARA實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和

4、PCR，目的基因擴(kuò)增引物由上海吉瑪生物公司合成。
　　結(jié)果：
　　1.脈沖剪切力(PSS)上調(diào)HUVECs ACE2的表達(dá)
　　分別給予體外培養(yǎng)的HUVECs不同時(shí)間（0、1、3、6、12、18小時(shí)）的PSS(12±4dyn/cm2,1Hz)和OSS（0±4 dyne/cm2,1Hz）刺激，qRT-PCR及WB分別檢測(cè)ACE2的mRNA及蛋白水平。結(jié)果顯示:與靜止對(duì)照（0小時(shí)）相比，PSS干預(yù)3小時(shí)后ACE2 mRNA

5、的表達(dá)水平即明顯升高，一直持續(xù)到18小時(shí)，這種上調(diào)作用仍顯著(p＜0.05);ACE2的蛋白表達(dá)水平自PSS刺激6小時(shí)后開始明顯上調(diào)，一直持續(xù)到18小時(shí)，高峰在12小時(shí)(p＜0.05)。而與靜止對(duì)照相比，OSS自3小時(shí)開始上調(diào)ACE2 mRNA的表達(dá)，直到12小時(shí)，而OSS干預(yù)18小時(shí)后，ACE2 mRNA水平恢復(fù)靜止對(duì)照組的水平;WB結(jié)果顯示，在OSS刺激6小時(shí)后，ACE2蛋白水平開始升高，一直持續(xù)至12小時(shí)，而18小時(shí)后ACE2蛋白

6、水平即降至靜止對(duì)照水平。
　　為進(jìn)一步明確PSS和OSS對(duì)ACE2表達(dá)的影響，分別給予體外培養(yǎng)的HUVECs以O(shè)SS和PSS刺激12小時(shí)，利用qRT-PCR，WB以及細(xì)胞免疫熒光的方法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞ACE2的表達(dá)情況。結(jié)果顯示:與靜止對(duì)照比較，PSS和OSS刺激12小時(shí)后，ACE2的mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯升高(p＜0.05);而與PSS比較，OSS則明顯減少內(nèi)皮細(xì)胞ACE2的表達(dá)(p＜0.05)。此外，與靜止對(duì)照組及OSS組比

7、較，PSS刺激HUVECs12小時(shí)后，細(xì)胞排列方向具有顯著的一致性，沿培養(yǎng)基流動(dòng)的長(zhǎng)軸排列，而靜止培養(yǎng)組與OSS刺激組，細(xì)胞排列方式則較為雜亂無序。
　　2.PSS通過上調(diào)ACE2調(diào)節(jié)HUVECs中Ang-(1-7)及AngⅡ的水平給予體外培養(yǎng)的HUVECs PSS干預(yù)12小時(shí)，ELISA法測(cè)定細(xì)胞漿中Ang-(1-7)及AngⅡ的水平。結(jié)果顯示:與靜止對(duì)照組比較，PSS顯著上調(diào)細(xì)胞中Ang-(1-7)的水平(p＜0.05)，而抑

8、制AngⅡ的水平(p＜0.05);分別轉(zhuǎn)染ACE2siRNA和陰性對(duì)照(NC) siRNA后，再給予PSS干預(yù)12小時(shí)，結(jié)果顯示ACE2siRNA明顯抑制PSS誘導(dǎo)的Ang-(1-7)水平增高，并促進(jìn)AngⅡ的水平(p＜0.05);在PSS刺激前，預(yù)孵育ACE2抑制劑DX600，結(jié)果顯示:與預(yù)孵育DMSO比較，DX600明顯抑制PSS誘導(dǎo)的Ang-(1-7)水平增高，并促進(jìn)AngⅡ的水平(p＜0.05)。
　　3.ACE2參與介導(dǎo)

9、PSS促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞NO的產(chǎn)生
　　為明確ACE2是否參與PSS調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞NO的生成，體外培養(yǎng)的HUVECs經(jīng)過轉(zhuǎn)染ACE2 siRNA或預(yù)孵育Ang-(1-7)抑制劑MLN-4760處理，再給予PSS刺激12小時(shí)，檢測(cè)細(xì)胞漿中NO水平，結(jié)果顯示:PSS明顯增加胞漿中NO的含量，而轉(zhuǎn)染ACE2 siRNA或MLN-4760預(yù)處理能夠顯著抑制PSS誘導(dǎo)的NO生成;另外，WB結(jié)果顯示，與靜止對(duì)照比較，PSS組細(xì)胞eNOS和p-

10、eNOS(Ser1177)的表達(dá)水平明顯升高(p＜0.05)，而轉(zhuǎn)染特異性siRNA抑制ACE2的表達(dá)后，再給予細(xì)胞PSS刺激12小時(shí)，PSS誘導(dǎo)的eNOS、p-eNOS的表達(dá)水平也受到明顯抑制(p＜0.05);
　　結(jié)論：
　　(1)脈沖剪切力顯著上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞ACE2的表達(dá)。
　　(2)ACE2參與調(diào)節(jié)脈沖剪切力促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞NO的合成和抑制細(xì)胞增殖。
　　(3)ACE2參與調(diào)節(jié)脈沖剪切力的抗炎作用，但不

11、參與脈沖剪切力調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用。
　?、?脈沖剪切力上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞ACE2表達(dá)的分子機(jī)制研究
　　目的：
　　(1)明確脈沖剪切力對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞ACE2 mRNA穩(wěn)定性及啟動(dòng)子活性的影響。
　　(2)明確脈沖剪切力是否通過AMPK-KLF2通路上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞ACE2的表達(dá)。
　　方法：
　　1.內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)及剪切力干預(yù)
　　復(fù)蘇前期實(shí)驗(yàn)凍存的HUVECs，4-7代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將HUVECs接種至

12、鋪有Ⅰ型鼠尾膠原的載玻片上，在完全培養(yǎng)基(M199、10％FBS、100U/mlPenicillin-Streptomycin、2ng/ml成纖維生長(zhǎng)因子）中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80-90％時(shí)，利用Flexcell剪切力儀給予細(xì)胞脈沖剪切力(PSS，1Hz，12±4dyn/cm2)刺激。
　　2.ACE2 mRNA穩(wěn)定性檢測(cè)
　　利用放線菌酮cycloheximide(CHX，0.1mg/ml)預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞30min，以阻斷

13、新的ACE2轉(zhuǎn)錄，然后再分別給予PSS(12±4dyn/cm2,1Hz)干預(yù)或靜止培養(yǎng)0、1、3、6、12小時(shí)，收集細(xì)胞并提取細(xì)胞總RNA，利用real time PCR檢測(cè)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)ACE2的mRNA水平，明確PSS是否影響ACE2 mRNA的穩(wěn)定性。
　　3.ACE2啟動(dòng)子活性檢測(cè)
　　利用實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的人ACE2啟動(dòng)子表達(dá)載體(pGL3-ACE2-promoter)，與PRL-TK載體一起共轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h小時(shí)后，再分

14、別給予PSS(12±4dyn/cm2,1Hz)刺激或靜態(tài)培養(yǎng)3小時(shí)，收集細(xì)胞利用Promega雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)ACE2啟動(dòng)子活性的變化。
　　結(jié)果：
　　1.PSS不影響內(nèi)皮細(xì)胞ACE2的mRNA穩(wěn)定性
　　利用放線菌酮阻斷新的ACE2合成后，再給予PSS分別刺激內(nèi)皮細(xì)胞1、3、
　　6、12小時(shí)，收集細(xì)胞蛋白后利用WB檢測(cè)ACE2的蛋白水平，結(jié)果顯示:與靜止對(duì)照組中的對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相比較，ACE

15、2 mRNA的降解速率沒有顯著變化(p＞0.05)。
　　2.PSS顯著增強(qiáng)ACE2啟動(dòng)子的活性
　　實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的人ACE2啟動(dòng)子載體(pGL3-ACE2-promoter)長(zhǎng)度為1908 bp;利用脂質(zhì)體2000分別轉(zhuǎn)染pGL3-ACE2-promoter與空載體pGL3-basicvector，24小時(shí)后給予細(xì)胞PSS刺激3小時(shí)，收集細(xì)胞，利用Promega雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒測(cè)定剪切力干預(yù)組及靜態(tài)對(duì)照組細(xì)胞

16、ACE2啟動(dòng)子的活性變化。結(jié)果顯示，對(duì)靜止對(duì)照組比較，PSS顯著增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞ACE2啟動(dòng)子的活性(p＜0.05)。
　　3.KLF2參與PSS調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞ACE2的表達(dá)
　　給予體外培養(yǎng)的HUVECs脈沖剪切力分別刺激0.5、1、3、6小時(shí)，WB結(jié)果顯示KLF2的蛋白表達(dá)水平自1小時(shí)開始明顯上升，持續(xù)至6小時(shí)(p＜0.05);轉(zhuǎn)染KLF2 siRNA抑制PSS誘導(dǎo)的KLF2表達(dá)，與陰性對(duì)照siRNA比較，PSS誘導(dǎo)的ACE2