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文檔簡介
1、本文分為以下兩個部分進行探討:
Ⅰ ACE2在脈沖剪切力調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞生物學(xué)功能中的作用
目的:
1.在體外細胞水平,明確脈沖剪切力對血管內(nèi)皮ACE2表達的影響。
2.在體外細胞水平,明確ACE2在脈沖剪切力調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞功能中的作用。
3.在整體動物水平,觀察剪切力對血管內(nèi)皮細胞ACE2表達的影響。
方法:
1.細胞培養(yǎng)
嚴格無菌條件下獲得新生兒臍帶,采用
2、胰酶消化法得到原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs),用含20%胎牛血清的M199培養(yǎng)基在37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),傳代后改用含10%胎牛血清的M199培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),并利用細胞免疫熒光法進行內(nèi)皮細胞鑒定,實驗選取4-8代內(nèi)皮細胞。
2.剪切力干預(yù)
將HUVECs接種至鋪有Ⅰ型鼠尾膠原的載玻片上,在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng),待細胞生長至90%時,利用Flexcell剪切力儀分別給予細胞脈沖剪切力(PSS,12±4
3、dyn/cm2,1Hz)和震蕩剪切力(OSS,0±4 dyne/cm2,1Hz)刺激不同的時間(0、1、3、6、12、18小時),實驗結(jié)束后收集細胞,利用qRT-PCR和Western blot檢測ACE2的mRNA及蛋白水平,明確不同形式的剪切力對內(nèi)皮細胞ACE2表達的影響的時間趨勢。
3.實時熒光定量PCR(qRT-PCR)
采用Trizol法提取細胞總RNA,使用TAKARA實時熒光定量PCR試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄和
4、PCR,目的基因擴增引物由上海吉瑪生物公司合成。
結(jié)果:
1.脈沖剪切力(PSS)上調(diào)HUVECs ACE2的表達
分別給予體外培養(yǎng)的HUVECs不同時間(0、1、3、6、12、18小時)的PSS(12±4dyn/cm2,1Hz)和OSS(0±4 dyne/cm2,1Hz)刺激,qRT-PCR及WB分別檢測ACE2的mRNA及蛋白水平。結(jié)果顯示:與靜止對照(0小時)相比,PSS干預(yù)3小時后ACE2 mRNA
5、的表達水平即明顯升高,一直持續(xù)到18小時,這種上調(diào)作用仍顯著(p<0.05);ACE2的蛋白表達水平自PSS刺激6小時后開始明顯上調(diào),一直持續(xù)到18小時,高峰在12小時(p<0.05)。而與靜止對照相比,OSS自3小時開始上調(diào)ACE2 mRNA的表達,直到12小時,而OSS干預(yù)18小時后,ACE2 mRNA水平恢復(fù)靜止對照組的水平;WB結(jié)果顯示,在OSS刺激6小時后,ACE2蛋白水平開始升高,一直持續(xù)至12小時,而18小時后ACE2蛋白
6、水平即降至靜止對照水平。
為進一步明確PSS和OSS對ACE2表達的影響,分別給予體外培養(yǎng)的HUVECs以O(shè)SS和PSS刺激12小時,利用qRT-PCR,WB以及細胞免疫熒光的方法檢測內(nèi)皮細胞ACE2的表達情況。結(jié)果顯示:與靜止對照比較,PSS和OSS刺激12小時后,ACE2的mRNA及蛋白表達水平均明顯升高(p<0.05);而與PSS比較,OSS則明顯減少內(nèi)皮細胞ACE2的表達(p<0.05)。此外,與靜止對照組及OSS組比
7、較,PSS刺激HUVECs12小時后,細胞排列方向具有顯著的一致性,沿培養(yǎng)基流動的長軸排列,而靜止培養(yǎng)組與OSS刺激組,細胞排列方式則較為雜亂無序。
2.PSS通過上調(diào)ACE2調(diào)節(jié)HUVECs中Ang-(1-7)及AngⅡ的水平給予體外培養(yǎng)的HUVECs PSS干預(yù)12小時,ELISA法測定細胞漿中Ang-(1-7)及AngⅡ的水平。結(jié)果顯示:與靜止對照組比較,PSS顯著上調(diào)細胞中Ang-(1-7)的水平(p<0.05),而抑
8、制AngⅡ的水平(p<0.05);分別轉(zhuǎn)染ACE2siRNA和陰性對照(NC) siRNA后,再給予PSS干預(yù)12小時,結(jié)果顯示ACE2siRNA明顯抑制PSS誘導(dǎo)的Ang-(1-7)水平增高,并促進AngⅡ的水平(p<0.05);在PSS刺激前,預(yù)孵育ACE2抑制劑DX600,結(jié)果顯示:與預(yù)孵育DMSO比較,DX600明顯抑制PSS誘導(dǎo)的Ang-(1-7)水平增高,并促進AngⅡ的水平(p<0.05)。
3.ACE2參與介導(dǎo)
9、PSS促進血管內(nèi)皮細胞NO的產(chǎn)生
為明確ACE2是否參與PSS調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞NO的生成,體外培養(yǎng)的HUVECs經(jīng)過轉(zhuǎn)染ACE2 siRNA或預(yù)孵育Ang-(1-7)抑制劑MLN-4760處理,再給予PSS刺激12小時,檢測細胞漿中NO水平,結(jié)果顯示:PSS明顯增加胞漿中NO的含量,而轉(zhuǎn)染ACE2 siRNA或MLN-4760預(yù)處理能夠顯著抑制PSS誘導(dǎo)的NO生成;另外,WB結(jié)果顯示,與靜止對照比較,PSS組細胞eNOS和p-
10、eNOS(Ser1177)的表達水平明顯升高(p<0.05),而轉(zhuǎn)染特異性siRNA抑制ACE2的表達后,再給予細胞PSS刺激12小時,PSS誘導(dǎo)的eNOS、p-eNOS的表達水平也受到明顯抑制(p<0.05);
結(jié)論:
(1)脈沖剪切力顯著上調(diào)血管內(nèi)皮細胞ACE2的表達。
(2)ACE2參與調(diào)節(jié)脈沖剪切力促進血管內(nèi)皮細胞NO的合成和抑制細胞增殖。
(3)ACE2參與調(diào)節(jié)脈沖剪切力的抗炎作用,但不
11、參與脈沖剪切力調(diào)節(jié)細胞凋亡的作用。
?、?脈沖剪切力上調(diào)血管內(nèi)皮細胞ACE2表達的分子機制研究
目的:
(1)明確脈沖剪切力對內(nèi)皮細胞ACE2 mRNA穩(wěn)定性及啟動子活性的影響。
(2)明確脈沖剪切力是否通過AMPK-KLF2通路上調(diào)內(nèi)皮細胞ACE2的表達。
方法:
1.內(nèi)皮細胞培養(yǎng)及剪切力干預(yù)
復(fù)蘇前期實驗凍存的HUVECs,4-7代細胞用于實驗。將HUVECs接種至
12、鋪有Ⅰ型鼠尾膠原的載玻片上,在完全培養(yǎng)基(M199、10%FBS、100U/mlPenicillin-Streptomycin、2ng/ml成纖維生長因子)中培養(yǎng),待細胞生長至80-90%時,利用Flexcell剪切力儀給予細胞脈沖剪切力(PSS,1Hz,12±4dyn/cm2)刺激。
2.ACE2 mRNA穩(wěn)定性檢測
利用放線菌酮cycloheximide(CHX,0.1mg/ml)預(yù)處理內(nèi)皮細胞30min,以阻斷
13、新的ACE2轉(zhuǎn)錄,然后再分別給予PSS(12±4dyn/cm2,1Hz)干預(yù)或靜止培養(yǎng)0、1、3、6、12小時,收集細胞并提取細胞總RNA,利用real time PCR檢測各個時間點ACE2的mRNA水平,明確PSS是否影響ACE2 mRNA的穩(wěn)定性。
3.ACE2啟動子活性檢測
利用實驗室前期構(gòu)建的人ACE2啟動子表達載體(pGL3-ACE2-promoter),與PRL-TK載體一起共轉(zhuǎn)染細胞24h小時后,再分
14、別給予PSS(12±4dyn/cm2,1Hz)刺激或靜態(tài)培養(yǎng)3小時,收集細胞利用Promega雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測各個時間點ACE2啟動子活性的變化。
結(jié)果:
1.PSS不影響內(nèi)皮細胞ACE2的mRNA穩(wěn)定性
利用放線菌酮阻斷新的ACE2合成后,再給予PSS分別刺激內(nèi)皮細胞1、3、
6、12小時,收集細胞蛋白后利用WB檢測ACE2的蛋白水平,結(jié)果顯示:與靜止對照組中的對應(yīng)時間點相比較,ACE
15、2 mRNA的降解速率沒有顯著變化(p>0.05)。
2.PSS顯著增強ACE2啟動子的活性
實驗室前期構(gòu)建的人ACE2啟動子載體(pGL3-ACE2-promoter)長度為1908 bp;利用脂質(zhì)體2000分別轉(zhuǎn)染pGL3-ACE2-promoter與空載體pGL3-basicvector,24小時后給予細胞PSS刺激3小時,收集細胞,利用Promega雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒測定剪切力干預(yù)組及靜態(tài)對照組細胞
16、ACE2啟動子的活性變化。結(jié)果顯示,對靜止對照組比較,PSS顯著增強內(nèi)皮細胞ACE2啟動子的活性(p<0.05)。
3.KLF2參與PSS調(diào)控內(nèi)皮細胞ACE2的表達
給予體外培養(yǎng)的HUVECs脈沖剪切力分別刺激0.5、1、3、6小時,WB結(jié)果顯示KLF2的蛋白表達水平自1小時開始明顯上升,持續(xù)至6小時(p<0.05);轉(zhuǎn)染KLF2 siRNA抑制PSS誘導(dǎo)的KLF2表達,與陰性對照siRNA比較,PSS誘導(dǎo)的ACE2
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