剪切力調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞Dickkopf1的表達(dá)與機(jī)制及對動脈粥樣硬化發(fā)生的影響.pdf

1、研究背景：
　　動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是最常見的心血管疾病之一，它的發(fā)病機(jī)理一直是心血管領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。動脈粥樣硬化斑塊好發(fā)于血管分叉、彎曲及狹窄等部位。局部剪切力的變化與斑塊分布特異性密切相關(guān)。在血管平直區(qū)域，平穩(wěn)的血流產(chǎn)生方向單一的生理性脈沖剪切力（剪切力≥12dyne/cm2），具有抑動脈粥樣硬化形成的保護(hù)作用。而在血管分叉等處，渦流產(chǎn)生，血流變?yōu)榉较蛭蓙y，速度明顯降低的震蕩剪切力（剪切力0±4

2、dyne/cm2），這一剪切力則具有促動脈粥樣硬化形成的作用。內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋于整個血管腔，直接接觸血流，長期處于血流剪切力的刺激下，能夠感受血流力學(xué)的變化，傳遞信號，維持血管穩(wěn)態(tài)。內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂是動脈粥樣硬化形成早期的關(guān)鍵步驟。
　　DKK家族是進(jìn)化過程中十分保守的基因家族，主要包括DKK1、DKK2、DKK3及DKK4四個成員，其中DKK1的研究最為廣泛。DKK1是經(jīng)典Wnt/β-catenin通路的分泌型抑制劑，可與細(xì)胞膜上K

3、rumen、LRP5/6等受體結(jié)合，阻礙正常Wnt受體復(fù)合物的形成，促進(jìn)胞質(zhì)中β-catenin的磷酸化降解，影響下游相關(guān)基因的表達(dá)，關(guān)閉Wnt通路，進(jìn)而影響相應(yīng)的生物學(xué)功能。
　　既往研究發(fā)現(xiàn)，DKK1與心血管疾病的發(fā)生密切關(guān)系。冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者血清及人的頸動脈及冠狀動脈斑塊中高表達(dá)的DKK1均提示DKK1與動脈粥樣硬化相關(guān)。但是，DKK1在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中所起的作用及相關(guān)機(jī)制尚不清楚，剪切力刺激下內(nèi)皮細(xì)胞中

4、DKK1的表達(dá)有著怎樣的變化亦未見報(bào)道。
　　研究目的：
　　1.探討不同剪切力對血管內(nèi)皮細(xì)胞中DKK1表達(dá)的調(diào)節(jié)作用;
　　2.明確DKK1在不同剪切力調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞黏附功能及內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接相關(guān)分子表達(dá)中的作用;
　　3.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)明確DKK1在病理剪切力作用區(qū)域動脈粥樣硬化發(fā)生中的作用及相關(guān)分子機(jī)制。
　　研究方法：
　　1.體外人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endo

5、thelial Cells，HUVECs)的提取與培養(yǎng)
　　無菌條件下獲取一段長約15-20cm的剖宮產(chǎn)新生兒臍帶，利用胰酶消化法提取臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，以10％ M199培養(yǎng)基重懸于小號細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)于37℃、5％CO2孵箱中，次日換液，清除未貼壁細(xì)胞。待細(xì)胞長至融合，傳代繼續(xù)培養(yǎng)。
　　2.體外不同剪切力干預(yù)
　　體外培養(yǎng)至4-7代的HUVECs用于剪切力干預(yù)實(shí)驗(yàn)。載玻片高壓滅菌，包被Ⅰ型鼠尾膠原，HUVECs種于

6、其上，待細(xì)胞密度達(dá)到約90％，分別給予靜止培養(yǎng)或3、6、12、24小時的生理性脈沖剪切力或病理性震蕩剪切力刺激，觀察不同剪切力對內(nèi)皮細(xì)胞中DKK1表達(dá)的影響。
　　3.小鼠頸總動脈部分結(jié)扎模型的構(gòu)建
　　通過小鼠頸總動脈部分結(jié)扎建立左側(cè)頸總動脈病理剪切力模型，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察不同剪切力對血管內(nèi)皮細(xì)胞中DKK1表達(dá)的影響。8周齡雄性C57BL/6小鼠麻醉后，于頸部正中切開皮膚，鈍性分離左頸總動脈，找到其四個分支，手術(shù)線結(jié)扎左

7、頸內(nèi)動脈、左頸外動脈及左頭臂動脈，保留左甲狀腺上動脈血流通暢。術(shù)后第二天行小鼠頸動脈超聲觀察術(shù)后左頸總動脈的血流情況，48小時后取材行蛋白質(zhì)印跡檢測已證實(shí)受剪切力調(diào)控的相關(guān)分子的表達(dá)變化，評估造模是否成功。
　　4.小鼠主動脈及頸總動脈en face免疫熒光染色
　　(1)小鼠主動脈取材:正常的8周齡雄性C57BL/6小鼠經(jīng)腹腔麻醉、心臟灌流、4％甲醛溶液固定后，分離主動脈弓及胸主動脈，大體解剖顯微鏡下去除血管周圍的結(jié)締組織

8、，縱行剖開主動脈弓及胸主動脈，進(jìn)行enface染色。
　　(2)小鼠頸總動脈取材:左側(cè)頸總動脈部分結(jié)扎術(shù)后48小時，手術(shù)組及假手術(shù)對照組C57BL/6小鼠經(jīng)麻醉，灌注及固定后，行左側(cè)頸總動脈取材，鏡下去除周圍結(jié)締組織，縱向剖開，以行en face染色。
　　en face免疫熒光染色步驟如下:將剖開的主動脈弓及頸總動脈置于含0.5％TritonⅩ-100的PBS溶液中通透10分鐘，封閉，一抗4℃孵育過夜，相應(yīng)的熒光二抗孵育，

9、DAPI染核，激光共聚焦顯微鏡下觀察并留取照片。
　　研究結(jié)果：
　　1.病理剪切力上調(diào)小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞中DKK1的表達(dá)
　　小鼠主動脈弓小彎側(cè)血管內(nèi)皮主要承受促動脈粥樣硬化的病理性震蕩剪切力及低剪切力，而胸主動脈直段血管內(nèi)皮承受抑動脈粥樣硬化的生理性脈沖剪切力。主動弓小彎側(cè)內(nèi)皮細(xì)胞中DKK1表達(dá)量明顯高于胸主動脈直段(P＜0.05)。小鼠左側(cè)頸總動脈部分結(jié)扎建立病理剪切力模型，與假手術(shù)組相比，手術(shù)組頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞中

10、DKK1表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.05)。說明在體內(nèi)，促動脈粥樣硬化的病理性剪切力可以上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞中DKK1的表達(dá)。
　　2.脈沖剪切力下調(diào)HUVECs中DKK1的表達(dá)，震蕩剪切力上調(diào)HUVECs中DKK1的表達(dá)
　　與靜止對照組相比，脈沖剪切力下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中DKK1 mRNA及蛋白表達(dá)，脈沖剪切力作用3小時及6小時DKK1表達(dá)下調(diào)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);震蕩剪切力上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中DKK1 mRNA及蛋白表達(dá)，與靜止對照

11、組相比，震蕩剪切力作用6小時及12小時DKK1表達(dá)上調(diào)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。分別給予HUVECs脈沖剪切力或震蕩剪切力刺激6小時，免疫熒光染色顯示，脈沖剪切力刺激后HUVECs中DKK1表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)，而震蕩剪切力刺激后HUVECs中DKK1的表達(dá)量則顯著升高(P＜0.05)。
　　3.DKK1參與不同剪切力對內(nèi)皮細(xì)胞黏附功能的調(diào)節(jié)
　　與靜止對照組相比，脈沖剪切力抑制內(nèi)皮細(xì)胞對單核細(xì)胞的黏附(P＜0

12、.05)，下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中黏附分子VCAM1、ICAM1及E-selectin的表達(dá)(P＜0.05);而過表達(dá)DKK1，與空載體陰性對照相比，能夠阻斷脈沖剪切力對內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞黏附的抑制作用(P＜0.05)，上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中VCAM1、ICAM1及E-selectin黏附分子的表達(dá)(P＜0.05)。
　　與靜止對照組相比，震蕩剪切力促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞對單核細(xì)胞的黏附(P＜0.05)，上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子VCAM1、ICAM1及E-sel

13、ectin的表達(dá)(P＜0.05); DKK1siRNA轉(zhuǎn)染能夠下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中VCAM1、ICAM1及E-selectin的表達(dá)(P＜0.05)，阻斷震蕩剪切力對內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞黏附的促進(jìn)作用(P＜0.05)。
　　4.DKK1參與不同剪切力對內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接相關(guān)分子表達(dá)的調(diào)節(jié)
　　與靜止對照組相比，脈沖剪切力上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接相關(guān)分子ZO1、ZO2、occludin及Claudin5的表達(dá)(P＜0.05);而過表達(dá)D

14、KK1，與空載體陰性對照組相比，上述分子的表達(dá)均下調(diào)(P＜0.05)。
　　與靜止對照組相比，震蕩剪切力下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接相關(guān)分子ZO1、ZO2、occludin及Claudin5的表達(dá)(P＜0.05);而干擾DKK1表達(dá)，上述分子的表達(dá)均上調(diào)(P＜0.05)。
　　5.DKK1干擾抑制病理剪切力作用區(qū)域AS的發(fā)生
　　慢病毒轉(zhuǎn)染后2周，ApoE-/-小鼠頸總動脈內(nèi)有明顯的GFP表達(dá)。與Con及Scramble對照

15、組相比，shRNA-DKK1組小鼠頸總動脈中DKK1 mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯下調(diào)(P＜0.05)，說明轉(zhuǎn)染安全有效。
　　高脂喂養(yǎng)，頸總動脈部分結(jié)扎術(shù)后3周，ApoE-/-小鼠結(jié)扎側(cè)（左側(cè)）頸總動脈中有明顯的AS斑塊生長。與Con對照組相比，shRNA-DKK1組AS斑塊病變范圍顯著降低(P＜0.05)。
　　高脂喂養(yǎng)3個月，ApoE-/-小鼠主動脈弓小彎側(cè)及主動脈弓分支處病理剪切力作用區(qū)域可見明顯斑塊生長。與Con對

16、照組相比，shRNA-DKK1組上述部位AS斑塊病變范圍顯著下降(P＜0.05)。
　　6.DKK1干擾抑制ApoE-/-小鼠病理剪切力作用區(qū)域血管內(nèi)皮與單核細(xì)胞黏附
　　頸總動脈部分結(jié)扎術(shù)后1周，與Con對照組相比，shRNA-DKK1組ApoE-/-小鼠結(jié)扎側(cè)（左側(cè)）頸總動脈血管內(nèi)皮與單核細(xì)胞的黏附顯著降低，內(nèi)皮黏附分子VCAM1、ICAM1及E-selectin的表達(dá)亦顯著下調(diào)(P＜0.05)。
　　7.DKK1

17、干擾上調(diào)ApoE-/-小鼠病理剪切力作用區(qū)域血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接相關(guān)分子的表達(dá)
　　左側(cè)頸總動脈部分結(jié)扎術(shù)后1周，Western Blotting及en face免疫熒光染色結(jié)果均顯示，與Con對照組相比，shRNA-DKK1組小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接相關(guān)分子ZO1、ZO2、occludin及Claudin5的表達(dá)均顯著上調(diào)(P＜0.05)。
　　研究結(jié)論：
　　1.脈沖剪切力下調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞中DKK1表達(dá)，震蕩剪