醉馬草內(nèi)生真菌分子檢測(cè)、基因型及產(chǎn)堿多樣性的研究.pdf

1、醉馬草(Achnatherum inebrians)為禾本科芨芨草屬的多年生烈性毒草，內(nèi)生真菌與醉馬草形成的共生體產(chǎn)生的次生代謝物質(zhì)是引起家畜中毒的原因。本論文以采自甘肅、內(nèi)蒙古、新疆等3個(gè)?。ㄗ灾螀^(qū)）的8個(gè)醉馬草種群為材料，分離獲得了醉馬草內(nèi)生真菌 Epichlo? gansuensis(Eg)和 Epichlo? gansuensis var. inebrians(Ei)，進(jìn)行了Eg和Ei菌株的形態(tài)比較、全基因組測(cè)序和比較基因組分析

2、，測(cè)定了共生體的生物堿成分和含量，分析了共生體種群多樣性及其分子系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。所獲主要結(jié)果如下：
　　1、從8個(gè)醉馬草種群的種子和幼苗中分離純培養(yǎng)得到Ei和Eg兩類醉馬草：Ei菌株e7478、e818-1……e818-10、e817-1……e817-10、ep4914、ep4916、NFR-2、eAIM-1、eXH-B1、eXH-B2、eXH-C共28個(gè)；Eg菌株eA168、eA169、eA170、eA171、eA172、eA17

3、3、eA185和eA186共8個(gè)。供試的8個(gè)醉馬草種群中都有Ei基因型，且它是其中6個(gè)種群的唯一基因型，而甘肅肅南SNB種群中的SNB-1、SNB-4和SNB-5種樣的所有單株為Eg基因型。
　　2、建立了適用于醉馬草內(nèi)生真菌的多基因PCR分子檢測(cè)和鑒定方法，包括Ei麥角生物堿合成相關(guān)基因dmaW，Eg吲哚二萜類生物堿合成相關(guān)基因idtG，交配型基因mtA和mtB,以及當(dāng)家基因tefA，獲得了醉馬草內(nèi)生真菌dmaW。idtG。mt

4、A和mtB基因的特異性引物。Ei和Eg的交配型不同，Ei為mtA，Eg為mtB。
　　3、對(duì)分離得到的Ei菌株e818-5和e7478進(jìn)行了全基因組測(cè)序，并與已完成測(cè)序的Eg菌株e7080進(jìn)行了比較基因組研究，發(fā)現(xiàn)參試的Ei菌株e818-5和e7478的基因組大小相近，分別為29.8Mb和25.4Mb，Eg菌株e7080的基因組為39.5 Mb。Ei菌株都有麥角類生物堿合成所需的基因簇EAS1和EAS2(Genebank:JX07

5、2969和JX273434)，但沒(méi)有吲哚二萜類生物堿合成所需的基因簇IDT；與Ei相反，Eg有吲哚二萜類生物堿合成所需的基因簇IDT，但是沒(méi)有合成麥角類生物堿的EAS基因簇。Ei和Eg兩者的基因組中都只有單拷貝的當(dāng)家基因。
　　4、人工接種構(gòu)建了 e7080－醉馬草共生體。采用質(zhì)譜分析(MS)方法，對(duì)新構(gòu)建的Eg7080醉馬草共生體、Ei醉馬草共生體和E-醉馬草生物堿成分和含量進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn) Ei醉馬草中含有麥角類生物堿，包

6、括大量的麥角新堿和麥角酸α羥基乙酰胺，少量的麥角酰胺和裸麥角堿；新構(gòu)建的Eg菌株e7080與醉馬草共生產(chǎn)生吲哚二萜類生物堿，包括大量的paspaline，少量的13-desoxypaxilline和paxilline，微量的paspaline B；而E-醉馬草中沒(méi)有檢測(cè)到麥角類生物堿和吲哚二萜類生物堿。醉馬草內(nèi)生真菌共生體所含生物堿的化學(xué)類型和與其共生的菌株的產(chǎn)堿基因型是一致的。
　　5、分子系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，3個(gè)不同的Ei菌

7、株e818。e817。e7478總是同屬一個(gè)分枝，Ei、Eg和Epichlo?sibirica的親緣關(guān)系較近，能夠歸入一個(gè)分枝，這三個(gè)已鑒定的亞洲芨芨草種的Epichlo?內(nèi)生真菌代表一個(gè)與其他已知的Epichlo?種進(jìn)化起源不同的家族系。Ei、Eg與Achnatherum pekinense和Epichlo? guerinii的親緣關(guān)系也較近。
　　綜上，將 Ei醉馬草內(nèi)生真菌從變種提升到種的水平，并將其重命名為Epichlo?