苦豆子內(nèi)生真菌遺傳多樣性及其產(chǎn)喹諾里西啶生物堿菌株的篩選.pdf

1、植物內(nèi)生真菌普遍存在于目前發(fā)現(xiàn)的各種陸生及水生植物中，其多樣性受多種因素的影響。不同的區(qū)域或位點(diǎn)、氣候條件、植被等均可影響內(nèi)生真菌類群的多樣性。研究發(fā)現(xiàn)，藥用植物中蘊(yùn)含著大量的有益內(nèi)生真菌，這些內(nèi)生真菌與宿主之間具有緊密的生態(tài)關(guān)系，其產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物在醫(yī)藥、植物病蟲害生物防治等方面的用途逐漸增大，成為尋找新的天然活性產(chǎn)物的重要方向。本文以寧夏靈武白芨灘自然保護(hù)區(qū)重要的沙生藥用植物苦豆子為研究對象，進(jìn)行了苦豆子內(nèi)生真菌的分離、鑒定、遺傳

2、多樣性及生態(tài)分布研究;苦豆子生物總堿中單堿檢測體系的優(yōu)化，以及產(chǎn)喹諾里西啶生物堿內(nèi)生真菌菌株的篩選和rDNA-ITS序列分析。研究結(jié)果如下:
　　1、從寧夏靈武白芨灘自然保護(hù)區(qū)不同土壤、不同優(yōu)勢植被類型的6個樣區(qū)采集的健康苦豆子，分離得到213株內(nèi)生真菌。同一植株不同組織中，內(nèi)生真菌數(shù)量以根部最多，其次為種子，葉部最少;淡灰鈣土中苦豆子內(nèi)生真菌數(shù)量比風(fēng)沙土中多;形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果表明，內(nèi)生真菌以鐮刀菌屬(Fusarium)、鏈格孢屬（

3、Alternaria）和莖點(diǎn)霉屬（Phoma）為優(yōu)勢屬，其中鐮刀菌屬(Fusarium)在各樣區(qū)中均有分布。
　　2、寧夏靈武白芨灘自然保護(hù)區(qū)6個樣區(qū)苦豆子內(nèi)生真菌具有豐富的種群組成，分離的213株內(nèi)生真菌菌株經(jīng)rDNA-ITS序列鑒定分為19個屬32個種，其中腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、交鏈格孢(Alternariaalternata)、細(xì)極鏈格孢(Alterna

4、riatenuissima)和草莖點(diǎn)霉(Phomaherbarum)為優(yōu)勢種。
　　3、建立TLC和HPLC同時分離測定苦豆子生物堿體系的優(yōu)化方法。薄層層析法(展開劑為氯仿-甲醇-氨水=8∶2∶0.1);高效液相色譜法的色譜柱為UltraⅡTMC18(5μm×250mm×4.6mm)、流動相為0.01mol/L磷酸鹽緩沖液-甲醇(45∶55)、檢測波長為216nm、流速為1.0mL/min、柱溫為30℃、進(jìn)樣量為10μL?；倍▔A和

5、苦參堿在200-900μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，R2分別為0.9994和0.9996，平均回收率(n=9)分別為99.47％和99.82％。
　　4、從59株苦豆子內(nèi)生真菌代表菌株中，經(jīng)TLC初步篩選，HPLC對其菌絲體提取物進(jìn)行分析，篩選出1株高活性產(chǎn)喹諾里西啶生物堿菌株XKYKDF40，其發(fā)酵液氧化苦參堿含量為145.73μg/mL。經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，菌株XKYKDF40為外瓶霉屬（Exophiala）的一