人己糖胺酶D的酶學(xué)特性、生物底物及催化機(jī)制的研究.pdf

1、糖基化修飾是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，參與生物體中的信號傳導(dǎo)、細(xì)胞識別等多種細(xì)胞活動，糖苷酶是一類水解糖基輟合物糖苷鍵的水解酶，糖基綴合物的正常水解是生物體代謝的必需途徑。糖基化修飾代謝異常與很多疾病密切相關(guān)，如家族黑蒙性白癡、山德霍夫氏病、Ⅱ型糖尿病、阿爾茨海默病和腫瘤等。人己糖胺酶D(HexD)是新發(fā)現(xiàn)的一種糖苷水解酶，但該酶的酶學(xué)特性、底物特異性及催化機(jī)制尚不清楚。
　　 本實(shí)驗(yàn)首先將HexD的cDNA序列構(gòu)建到質(zhì)粒pE

2、T3C中，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3) plysS后，利用Ni-NTA親和層析技術(shù)純化出該酶，測定該酶最適pH、熱穩(wěn)定性和金屬離子對該酶活性的影響。同時(shí)，利用生物信息分析同家族酶蛋白序列，找到兩個(gè)可能的關(guān)鍵催化氨基酸，分別是148位的Asp和149位的Glu，通過氨基酸突變分析確定兩者的催化作用。然后，通過HexD對多種底物如熒光底物、糖肽和糖脂的水解作用，與另外兩種己糖胺酶HexA/HexB和OGA作對比，分析三種己糖胺酶

3、底物特異性的異同點(diǎn)。最后，利用表達(dá)純化出的HexD蛋白，制備HexD多克隆抗體。具體結(jié)果如下。
　　 成功構(gòu)建了pET3C/HexD重組質(zhì)粒，表達(dá)了大量的可溶性HexD蛋白。以4-甲基傘形酮-2-乙酰氨基-2-脫氧半乳糖(4-MU-O-GalNAc)為熒光底物，測定該酶的最適反應(yīng)pH值為5.5，最適反應(yīng)溫度為37℃，且該酶的熱穩(wěn)定性較好，在50℃下放置半小時(shí)仍有較高活性。研究金屬離子對該酶的影響發(fā)現(xiàn)，1mM的金屬離子(CuSO4

4、、FeSO4·7H2O、MgCl2·6H2O、CaCl2、NiSO4·6H2O、AlCl3·6H2O、ZnSO4·7H2O、MnCl2)對該酶活性影響不大，不過10mM AlCl3、 CuSO4、FeSO4·7H2O對該酶有不同程度的抑制，其中Al3+抑制作用最強(qiáng)。通過對HexD序列中148位的天冬氨酸和149位的谷氨酸定點(diǎn)突變，我們發(fā)現(xiàn)將148位Asp突變?yōu)镚lu和Asn之后，酶的活性徹底失去，而將149位的Glu突變?yōu)锳sp和Gln

5、之后，未發(fā)現(xiàn)酶活性的明顯降低，表明HexD序列中Asp148為親核氨基酸，Glu149為酸堿催化氨基酸。利用4-MU熒光基團(tuán)連接的多種糖基化底物和糖肽水解實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)HexD偏好于水解O-β-GalNAc底物，為了探討其在生命體中的底物，我們合成了β-GalNAc連接的糖脂，遺憾的是通過質(zhì)譜、TLC方法未檢測到HexD對該糖脂的水解活性。另外，利用大腸桿菌表達(dá)純化出的HexD蛋白制備特異性多克隆抗體，Western blotting檢