氯喹抑制NLRP3炎癥小體活化介導(dǎo)其抗炎效應(yīng)的機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　膿毒癥是感染所致的一種臨床綜合征，主要表現(xiàn)為因宿主免疫應(yīng)答失調(diào)引發(fā)的多器官功能紊亂。膿毒癥是臨床危重癥病人死亡的首要因素之一，但目前尚無可靠有效的防治藥物用于臨床治療。業(yè)已證實(shí)，機(jī)體內(nèi)過度的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致膿毒癥發(fā)病和多器官功能紊亂的核心病理事件。因此，對(duì)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行拮抗是膿毒癥藥物研發(fā)的重要方向。
　　炎癥小體是近年來發(fā)現(xiàn)的新型炎癥調(diào)控平臺(tái)，在機(jī)體炎癥發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，其中NLRP3炎癥小體是目前

2、研究最為廣泛的炎癥小體類型。近來發(fā)現(xiàn)，NLRP3的活化與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。研究顯示多種誘發(fā)膿毒癥的重要病原體分子模式(PAMPs)都可在機(jī)內(nèi)體激活NLRP3炎癥小體，介導(dǎo)IL-1家族炎癥因子成熟釋放并導(dǎo)致免疫細(xì)胞焦亡等的發(fā)生，因此它的過度活化在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。NLRP3炎癥小體的活化過程包括蛋白組分轉(zhuǎn)錄表達(dá)和蛋白復(fù)合物裝配。PAMPs激活模式識(shí)別受體（PRRs）下游胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑啟動(dòng)蛋白組分的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，又被稱為第

3、一信號(hào)(signal1)，如LPS。LPS被細(xì)胞TLR4識(shí)別后激活NF-κB和MAPK信號(hào)通路啟動(dòng)炎癥因子前體和NLRP3轉(zhuǎn)錄表達(dá)。其他激活因子啟動(dòng)蛋白復(fù)合物裝配，被稱為是第二信號(hào)(signal2)，如ATP。第二信號(hào)調(diào)控NLRP3炎癥小體復(fù)合物裝配的具體分子機(jī)制尚不清楚，但近來鉀離子外流模型得到更多的認(rèn)可，ATP促進(jìn)胞內(nèi)鉀離子外流介導(dǎo)NLRP3、ASC和caspase-1組裝成蛋白嵌合體，激活炎癥小體下游效應(yīng)。
　　氯喹最早作為

4、抗瘧疾藥物廣泛應(yīng)用于臨床，近年來在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫疾病中也有應(yīng)用。我們課題組最先報(bào)道了氯喹對(duì)膿毒癥模型小鼠的保護(hù)作用，且發(fā)現(xiàn)該作用與其介導(dǎo)的TLR4通路的抗炎效應(yīng)密切相關(guān)。在后續(xù)研究中，我們還發(fā)現(xiàn)氯喹通過影響蛋白泛素化系統(tǒng)抑制其炎癥效應(yīng)，提示氯喹可能存在多重的抗炎機(jī)制。氯喹對(duì)膿毒癥模型小鼠的保護(hù)作用是否與NLRP3炎癥小體活化有關(guān)，具體分子機(jī)制是與signal1還是signal2有關(guān)，目前均不清楚，也無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)

5、道。因此，本課題首先在膿毒癥動(dòng)物模型中展開氯喹對(duì)NLRP3活化的效應(yīng)研究。進(jìn)而在體外建立巨噬細(xì)胞NLRP3炎癥小體激活模型，從轉(zhuǎn)錄起始和裝配調(diào)控層面研究其調(diào)控NLRP3炎癥小體活化的分子機(jī)制。最終明確氯喹調(diào)控NLRP3炎癥小體活化的作用和分子機(jī)制，為擴(kuò)大氯喹的適應(yīng)癥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為基于炎癥小體抑制作用的抗膿毒癥藥物研究提供新思路。
　　方法:
　　1.氯喹體內(nèi)抑制NLRP3炎癥小體活化及其介導(dǎo)膿毒癥模型小鼠保護(hù)效應(yīng)的作用研

6、究
　　1.1.通過對(duì)BABL/c小鼠尾靜脈注射內(nèi)毒素建立死亡率高于70％的膿毒癥動(dòng)物模型。腹腔給藥的方式給予30mg/kg或10mg/kg劑量的氯喹，觀察記錄模型小鼠的7天生存情況。分別在LPS攻擊6h和24h后采集小鼠外周血，檢測(cè)血液中ALT和AST水平;在相同時(shí)相點(diǎn)獲取小鼠肝、脾、肺等組織進(jìn)行HE染色觀察藥物對(duì)LPS介導(dǎo)的臟器損傷的影響，明確藥物對(duì)模型動(dòng)物的保護(hù)作用。
　　1.2.在1.1建立的模型動(dòng)物基礎(chǔ)上，給藥30

7、mg/kg劑量的氯喹，分別于LPS攻擊后6h、12h和24h采集小鼠外周血和腹腔灌洗液。ELISA檢測(cè)外周血中IL-1β和IL-18釋放水平。同時(shí)獲取小鼠肝、脾和肺等組織進(jìn)行組織勻漿，檢測(cè)勻漿液中IL-1β和IL-18蛋白水平，capase-1活化水平和NLRP3蛋白表達(dá)水平，明確氯喹對(duì)NLRP3炎癥小體活化及其下游效應(yīng)的作用。
　　2.氯喹抑制NLRP3炎癥小體活化的作用機(jī)制研究
　　2.1.體外分離誘導(dǎo)骨髓源巨噬細(xì)胞(B

8、MDMs)，激光共聚焦和流式細(xì)胞儀檢測(cè)F4/80陽性細(xì)胞率;通過LPS和ATP刺激建立體外LPS介導(dǎo)的NLRP3炎癥小體激活細(xì)胞模型;不同劑量氯喹處理細(xì)胞后檢測(cè)細(xì)胞上清中IL-1β和IL-18釋放水平;蛋白免疫印跡法(WB)檢測(cè)藥物作用后細(xì)胞裂解液和細(xì)胞上清中的ASC、caspase-1前體和caspase-1 p10表達(dá)水平;不同ATP作用時(shí)相點(diǎn)藥物影響細(xì)胞LDH釋放率;檢測(cè)藥物抑制其它NLRP3炎癥小體激活因子促進(jìn)IL-1β釋放的影

9、響;在腹腔巨噬細(xì)胞系中觀察藥物對(duì)IL-1β釋放的影響;明確氯喹對(duì)LPS和ATP介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞NLRP3炎癥小體活化的作用。
　　2.2.ELISA檢測(cè)氯喹對(duì)細(xì)胞內(nèi)IL-1β和IL-18前體表達(dá)水平和細(xì)胞上清中的成熟釋放水平的影響;RT-qPCR檢測(cè)氯喹影響LPS介導(dǎo)的IL-1β和IL-18的轉(zhuǎn)錄水平;進(jìn)一步檢測(cè)氯喹對(duì)NLRP3基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平的影響;明確氯喹對(duì)NLRP3炎癥小體活化信號(hào)一通路的作用。WB檢測(cè)氯喹影響LPS

10、介導(dǎo)的NF-κB p65磷酸化水平、IκBα磷酸化水平和IκBα總蛋白降解降解水平;激光共聚焦觀察NF-κB p65核轉(zhuǎn)位情況;WB檢測(cè)氯喹影響MAPK通路中ERK、P38和JNK的激活水平;明確氯喹作用于炎癥小體蛋白組分轉(zhuǎn)錄從而調(diào)控NLRP3炎癥小體活化的分子機(jī)制。
　　2.3.改變氯喹作用階段或洗滌細(xì)胞去除藥物后檢測(cè)IL-1β釋放變化;激光共聚焦觀察免疫熒光標(biāo)記的ASC蛋白在胞內(nèi)形成ASC specks，計(jì)算ASC speck

11、s陽性細(xì)胞百分率;不同濃度鉀離子影響氯喹抑制1L-1β釋放，檢測(cè)氯喹影響胞內(nèi)鉀離子濃度，比較氯喹對(duì)鉀離子外流效應(yīng)的影響，明確氯喹通過影響蛋白復(fù)合物裝配調(diào)控NLRP3炎癥小體活化。Affymetrix基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)氯喹影響LPS介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化的差異表達(dá)基因;GO富集分析鉀離子代謝相關(guān)的差異表達(dá)基因;RT-qPCR和WB檢測(cè)氯喹影響ATP1B3的基因表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平;WB檢測(cè)siATP1B3-1、siATP1B3-2、siAT

12、P1B3-3干擾后ATP1B3蛋白表達(dá)水平，確認(rèn)siRNA對(duì)ATP1B3蛋白表達(dá)干擾作用;siATP1B3后對(duì)LPS和ATP激活的NLRP3炎癥小體的下游效應(yīng)的影響;檢測(cè)siATP1B3后細(xì)胞IL-1β釋放、caspase-1激活水平，確認(rèn)氯喹通過ATP1B3影響NLRP3炎癥小體活化的作用。
　　結(jié)果:
　　1.氯喹體內(nèi)抑制NLRP3炎癥小體活化及其介導(dǎo)膿毒癥模型小鼠保護(hù)效應(yīng)的作用研究
　　1.1.模型組小鼠7天生存

13、率低于30％，30mg/kg氯喹顯著提高模型組小鼠生存率(p=0.0155);模型組小鼠肺組織出現(xiàn)可見彌漫性出血、水腫，伴有散在炎細(xì)胞侵潤(rùn)，氯喹明顯減輕該效應(yīng);氯喹顯著抑制模型動(dòng)物體內(nèi)升高的血清ALT和AST;表明氯喹減輕模型動(dòng)物器官損傷，提高膿毒癥模型小鼠生存率。
　　1.2.血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組在6h、12h和24h的IL-1β和IL-18顯著高于生理鹽水對(duì)照組，氯喹顯著抑制IL-1β和IL-18釋放;同時(shí)，在腹腔灌洗液

14、中檢測(cè)到與血清學(xué)相似效應(yīng);在肝臟和肺組織中均檢測(cè)到模型組小鼠IL-1β和IL-18水平顯著上調(diào)，氯喹對(duì)該上調(diào)效應(yīng)有顯著抑制作用;WB檢測(cè)結(jié)果顯示氯喹顯著抑制LPS攻擊引起的caspase-1激活;同時(shí)，在組織中還發(fā)現(xiàn)氯喹抑制模型組的NLRP3蛋白表達(dá)水平上調(diào)。表明氯喹抑制體內(nèi)NLRP3炎癥小體激活及其下游效應(yīng)。
　　2.氯喹抑制NLRP3炎癥小體活化的作用機(jī)制研究
　　2.1.體外分離誘導(dǎo)獲得純度較高的BMDMs中，氯喹劑量

15、-效應(yīng)依賴性抑制LPS和ATP介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞IL-1β和IL-18釋放;WB檢測(cè)結(jié)果顯示LPS和ATP激活caspase-1p10生成，氯喹顯著抑制該作用且不影響caspase-1前體和ASC蛋白表達(dá);LPS和ATP介導(dǎo)細(xì)胞LDH快速釋放，氯喹顯著抑制該效應(yīng);氯喹能夠抑制nigericin介導(dǎo)的IL-1β成熟釋放;在腹腔巨噬細(xì)胞中也觀察氯喹具有相似的作用，表明氯喹下調(diào)巨噬細(xì)胞NLRP3炎癥小體活化，減少IL-1β和IL-18成熟釋放，抑

16、制細(xì)胞焦亡。
　　2.2.細(xì)胞內(nèi)蛋白水平檢測(cè)結(jié)果提示氯喹抑制IL-1β和IL-18前體表達(dá)水平，通過RT-qPCR檢測(cè)確定氯喹通過抑制IL-1β和IL-18轉(zhuǎn)錄降低前體的表達(dá);同時(shí)氯喹通過抑制Nlrp3轉(zhuǎn)錄水平降低NLRP3表達(dá)。LPS上調(diào)NF-κB p65(ser536)和IκBα蛋白磷酸化水平，促進(jìn)IκBα蛋白降解，從而激活巨噬細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號(hào)通路，氯喹對(duì)NF-κB信號(hào)通路具有抑制效應(yīng);LPS明顯增強(qiáng)NF-κB p65核轉(zhuǎn)

17、位效應(yīng)，氯喹明顯抑制NF-κB p65核轉(zhuǎn)位水平;另外氯喹抑制MAPK信號(hào)通路的ERK、JNK和p38的磷酸化激活水平。上述結(jié)果表明氯喹通過抑制NF-κB和MAPK信號(hào)通路抑制NLRP3蛋白組分的轉(zhuǎn)錄水平，從而負(fù)調(diào)控NLRP3炎癥小體活化。
　　結(jié)論:
　　1.氯喹體內(nèi)能夠抑制NLRP3炎癥小體活化，降低IL-1家族炎癥因子成熟，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)膿毒癥模型小鼠的保護(hù)作用。
　　2.氯喹在體外抑制LPS和ATP介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞N