新城疫病毒激活NLRP3炎癥小體及其作用.pdf

1、新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV)屬于副黏病毒科（Paramyxoviridae）禽腮腺炎病毒屬（Avulavirus），基因組為單股負(fù)鏈不分節(jié)的RNA。NDV能引起對(duì)禽類(lèi)高度致死的疾病新城疫，但對(duì)人類(lèi)而言，NDV并不致病，而是一種重要的溶瘤病毒，研究NDV抗腫瘤的機(jī)制有利于NDV在抗腫瘤治療中的應(yīng)用。通常認(rèn)為NDV抗腫瘤的效果源于病毒感染導(dǎo)致的細(xì)胞死亡和刺激天然免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。病毒感染會(huì)引起細(xì)胞

2、死亡，但其機(jī)制并不相同，目前研究發(fā)現(xiàn)NDV能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬，凋亡是一種由半胱天冬酶（Caspase）調(diào)節(jié)的，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)固縮，細(xì)胞膜逐漸形成凋亡小體的細(xì)胞死亡方式，不引起炎癥，自噬同樣不引起炎癥，細(xì)胞發(fā)生自噬會(huì)降解細(xì)胞組分，在細(xì)胞內(nèi)形成自噬泡，研究發(fā)現(xiàn)NDV導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡在抗腫瘤效應(yīng)中發(fā)揮了重要的作用，而引起的細(xì)胞自噬能通過(guò)抑制凋亡促進(jìn)病毒復(fù)制，使病毒能大量復(fù)制，進(jìn)而有利于其抗腫瘤，因此我們推測(cè)NDV是否引起其他死亡方式發(fā)揮抗腫瘤

3、的作用，此外，NDV如何調(diào)節(jié)宿主天然免疫系統(tǒng)從而成功殺死腫瘤細(xì)胞的機(jī)制有待研究。
　　天然免疫反應(yīng)是抵御病原微生物的第一道防線，其中炎癥小體是一種大分子的復(fù)合信號(hào)平臺(tái)，它能活化前炎性因子pro-IL-1β和pro-IL-18，誘導(dǎo)一種細(xì)胞炎性死亡—焦亡（pyroptosis）；炎性因子IL-1β和IL-18的分泌需要兩個(gè)信號(hào)，第一信號(hào)是pro-IL-1β和pro-IL-18的表達(dá)，這由轉(zhuǎn)錄激活因子NF-κB信號(hào)通路調(diào)控，上游主要是

4、模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors，PRRs)，例如Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)等，第二信號(hào)來(lái)源于炎癥小體的激活，它能導(dǎo)致Caspase-1自催化激活，活化的Caspase-1剪切pro-IL-1β和pro-IL-18，形成有功能的活性形式；焦亡不同于其他細(xì)胞死亡方式，由 Caspase-1調(diào)節(jié)，焦亡導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂并釋放大量炎癥因子和病原微生物，引起病理性炎癥。

5、NDV在發(fā)揮抗腫瘤作用中是否會(huì)通過(guò)炎性小體的途徑刺激機(jī)體的天然免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生焦亡尚不清楚，圍繞“炎癥小體—炎癥反應(yīng)”信號(hào)通路為主要方向，利用NDV病毒與THP-1誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞模型進(jìn)行了一系列的研究，研究結(jié)果表明：
　?。?）NDV感染PMA誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞導(dǎo)致IL-1β分泌上調(diào)，THP-1細(xì)胞經(jīng)PMA誘導(dǎo)分化形成巨噬細(xì)胞，NDV強(qiáng)毒株Herts/33感染12h后，IL-1β分泌顯著上調(diào)，IL-1β分泌量與病毒感染

6、時(shí)間和計(jì)量正相關(guān)，但UV滅活的病毒不能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌IL-1β，通常IL-1β由Caspase-1剪切，Caspase-1的活性由炎癥小體調(diào)控，采用Caspase-1的抑制劑處理后發(fā)現(xiàn)NDV誘導(dǎo)的IL-1β顯著下調(diào)，表明NDV能誘導(dǎo)IL-1β分泌，且該活性由Caspase-1調(diào)控，以上結(jié)果表明NDV感染巨噬細(xì)胞能夠激活炎性小體，誘導(dǎo)IL-1β分泌。
　　（2）NDV激活NLRP3炎癥小體，我們通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)shRNA的THP-

7、1細(xì)胞系，干擾NLRP3的表達(dá)，Western blot結(jié)果顯示NLRP3干擾細(xì)胞系中NLRP3的表達(dá)水平下降，已知ATP是NLRP3的陽(yáng)性刺激物，因此采用LPS+ATP刺激干擾NLRP3的THP-1細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在干擾細(xì)胞系中，ATP誘導(dǎo)的IL-1β分泌顯著下降，這表明NLRP3干擾成功。NDV感染該細(xì)胞系后，IL-1β分泌量同樣下降了，同時(shí)還構(gòu)建了NLRP3炎癥小體的其他組分的干擾細(xì)胞系，ASC和pro-Caspase-1干擾細(xì)胞系

8、，結(jié)果同樣顯示NDV誘導(dǎo)的IL-1β水平下調(diào)；還通過(guò)NLRP3敲除小鼠的骨髓源巨噬細(xì)胞（bone marrow-derivedmacrophages，BMDM）驗(yàn)證，以上結(jié)果證明NDV可以激活NLRP3炎癥小體。
　?。?）NDV感染激活炎癥小體，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生焦亡；炎癥小體活化能誘導(dǎo)一種細(xì)胞死亡方式—焦亡，分析NDV對(duì)NLRP3干擾細(xì)胞系的細(xì)胞毒性，細(xì)胞接種1MOI的Herts/33后，18h檢查細(xì)胞死亡情況，相比對(duì)照組，干擾細(xì)胞

9、系均存活率更高，為了進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)果，采用了Caspase-1、Caspase-3和Caspase抑制劑處理細(xì)胞，其中Caspase-1調(diào)節(jié)焦亡，Caspase-3調(diào)節(jié)凋亡，Caspase能抑制所有該家族的酶類(lèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制劑能下調(diào)細(xì)胞死亡率，進(jìn)一步研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)NDV感染THP-1和HeLa細(xì)胞均能誘導(dǎo)GSDMD的剪切，剪切下來(lái)的GSDMD的氨基端能直接誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡，以上結(jié)果顯示NDV感染可以誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體活化，并進(jìn)一步引起細(xì)胞

10、焦亡。
　　（4）炎癥小體活化能抑制NDV復(fù)制，0.01 MOI Herts/33接種THP-1細(xì)胞后，不同時(shí)間點(diǎn)檢查病毒滴度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在60h時(shí)，在NLRP3，ASC和Caspase-1的干擾細(xì)胞系中，病毒滴度較高，病毒復(fù)制可能得益于細(xì)胞未發(fā)生焦亡，延長(zhǎng)了病毒復(fù)制時(shí)間，為了進(jìn)一步驗(yàn)證此結(jié)果，我們同樣測(cè)定了Caspase-1、Caspase-3和Caspase抑制劑處理細(xì)胞中的病毒滴度，結(jié)果一致，這表明NLRP3炎癥小體在抵抗ND

11、V感染中發(fā)揮重要作用。
　　（5）NDV的P和V蛋白能抑制NLRP3炎癥小體活化誘導(dǎo)的IL-1β分泌；我們構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)病毒蛋白P、V、W和NP的THP-1細(xì)胞系，相比對(duì)照組，表達(dá)P和V蛋白的細(xì)胞在LPS+ATP的刺激下，細(xì)胞上清中檢查到更少量的IL-1β，為了驗(yàn)證這一結(jié)果，選擇天然缺失NLRP3和ASC的293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染炎癥小體組分，重建NLRP3炎癥小體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)P和V蛋白同樣能抑制IL-1β的分泌，在293T中轉(zhuǎn)染NLRP

12、3和ASC與病毒蛋白，間接免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)P和V蛋白與NLRP3共定位，以上結(jié)果證明NDV的P與V蛋白抑制NLRP3炎癥小體活化。
　　本文使用THP-1細(xì)胞，證明了NDV能誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體的活化，并引起細(xì)胞炎性死亡焦亡，在細(xì)胞水平上驗(yàn)證了NLRP3炎癥小體與病毒復(fù)制的關(guān)系，NLRP3炎癥小體是細(xì)胞對(duì)NDV感染的天然免疫反應(yīng)，能抑制病毒復(fù)制，而病毒蛋白P和V能抑制NLRP3炎癥小體的活性，本研究為進(jìn)一步揭示NDV抗腫瘤機(jī)制和