NLRP3炎癥小體促進草酸鈣腎結(jié)石形成機制的初步研究.pdf

1、目的：
　　明確草酸鈣腎結(jié)石形成過程中NLRP3炎癥小體激活的機制，探討NLRP3炎癥小體促進草酸鈣腎結(jié)石形成的機制。
　　方法：
　　通過免疫組化檢測分析人草酸鈣結(jié)石腎組織與正常腎組織組 NLRP3、Caspase-1及 IL-1β的表達水平差異；培養(yǎng) HK-2細胞，使用不同濃度的草酸（0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,2.0mmol/L）處理細胞24h后，通過檢測細胞培養(yǎng)基中的LDH的含量、DAP

2、I細胞核染色結(jié)果、MTT法以及CCK-8法分析草酸對HK-2細胞的毒性及活性的影響；草酸與COM共培養(yǎng)于HK-2細胞24h后，使用相差顯微鏡觀察細胞表面晶體的粘附情況；通過Western blotting法和RT-qPCR分別分析草酸作用于 HK-2細胞24h后對 NLRP3、Caspase-1及 IL-1β蛋白水平及mRNA表達量的影響；應用RT-qPCR檢測分析草酸作用于HK-2細胞24h后對HAS1、HAS2、HAS3、OPN以及

3、CD44 mRNA表達量的影響；草酸作用于HK-2后，采用氧化敏感的熒光探針 DCFH-DA檢測細胞中 ROS；使用 ROS抑制劑NAC預處理HK-2細胞2h，然后草酸作用于HK-2細胞24h，Western blotting和RT-qPCR分別檢測分析NLRP3的蛋白水平及mRNA的表達量；使用RNA干擾技術，將NLRP3-SiRNA轉(zhuǎn)染HK-2細胞后，相差顯微鏡觀察細胞表面晶體粘附變化RT-qPCR法分別檢測HAS1、HAS2、HA

4、S3、OPN以及CD44 mRNA表達水平變化；采用乙二醇法復制 SD大鼠草酸鈣腎結(jié)石模型，通過 HE、Pizzolato染色法以及偏光顯微鏡觀察大鼠腎組織結(jié)石形成情況，并通過 Western blotting法和RT-qPCR檢測大鼠腎組織中NLRP3、Caspase-1及IL-1β蛋白和mRNA表達差異,以及HAS1、HAS2、HAS3、OPN以及CD44 mRNA表達水平變化。實驗數(shù)據(jù)整理后均采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計分析。

5、
　　結(jié)果：
　　免疫組化染色結(jié)果顯示人草酸鈣腎組織標本中NLRP3、Caspase-1以及IL-1β的蛋白表達水平高于人正常腎組織，進而說明草酸鈣腎結(jié)石形成過程中存在NLRP3炎癥小體的激活；培養(yǎng)基中 LDH含量測定結(jié)果顯示草酸濃度在0.8mmol/L時，LDH的含量顯著高于草酸濃度在0-0.6mmol/L(P＜0.05)，草酸濃度在0-0.8mmol/L時，DAPI染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)各濃度梯度內(nèi)細胞數(shù)量沒有明顯差異，當草酸濃度

6、1.0mmol/L時，細胞數(shù)量開始顯著減少(P＜0.05)，MTT法以及CCK-8結(jié)果顯示草酸濃度為1.0mmol/L時(P＜0.05)，影響了細胞活性，對腎小管上皮細胞具有細胞毒性，造成了細胞損傷；草酸(0.8mmol/L)作用于HK-2細胞24h后，使用相差顯微鏡觀察細胞表面COM晶體粘附數(shù)量明顯多于對照組（P＜0.05）；NLRP3、Caspase-1及IL-1β蛋白水平和mRNA表達量在草酸(0.8mmol/L)作用于HK-2細

7、胞24h后均高于對照組（P＜0.05），且HK-2細胞表面粘附因子HAS1、HAS2、HAS3、OPN以及CD44的mRNA表達水平亦均高于對照組（P＜0.05）；采用DCFH-DA法檢測HK-2細胞內(nèi)ROS，發(fā)現(xiàn)草酸(0.8mmol/L)可引起細胞內(nèi)發(fā)生氧化應激產(chǎn)生ROS，且加入ROS抑制劑NAC作用后NLRP3的蛋白水平及mRNA表達量明顯降低（P＜0.05），進而表明了高濃度草酸作用于HK-2細胞后細胞內(nèi)發(fā)生了氧化應激產(chǎn)生ROS，

8、并導致NLRP3炎性體的激活；NLRP3-SiRNA轉(zhuǎn)染HK-2細胞后，細胞表面晶體粘附數(shù)量顯著少于對照組（P＜0.05），且細胞內(nèi)粘附因子HAS1、HAS2、HAS3、OPN以及CD44 mRNA表達量亦均低于對照組（P＜0.05）；使用乙二醇法構(gòu)建 SD大鼠草酸鈣腎結(jié)石模型，通過 HE、Pizzolato染色法及偏光顯微鏡發(fā)現(xiàn)試驗組大鼠腎組織內(nèi)晶體形成，且 NLRP3、Caspase-1及IL-1β蛋白水平和mRNA表達量顯著高于對

9、照組（P＜0.05），組織內(nèi)粘附因子HAS1、HAS2、HAS3、OPN以及CD44 mRNA表達量亦均高于對照組（P＜0.05），通過體內(nèi)試驗進一步證實了NLRP3炎癥小體的激活參與了草酸鈣腎結(jié)石的形成。
　　結(jié)論：
　　草酸鈣腎結(jié)石形成過程中存在NLRP3炎癥小體的激活，NLRP3炎癥小體通過細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生而激活；NLRP3炎癥小體激活后通過改變腎小管上皮對晶體的粘附性進而參與結(jié)石的形成；同時為草酸鈣腎結(jié)石的發(fā)生機制