小鼠卵母細胞孤雌激活、去核方法及受精卵體外培養(yǎng)研究.pdf

1、小鼠卵母細胞相對較小，顯微操作易導(dǎo)致胞質(zhì)散裂，因此小鼠核移植難度較大，成功率較低，其中培養(yǎng)液、激活條件、去核方法都極大地影響其成功率。本研究通過對小鼠受精卵體外培養(yǎng)體系，MII期卵母細胞孤雌激活條件的篩選以及探討MII期卵母細胞的去核方法為小鼠體細胞核移植的成功奠定基礎(chǔ)。 1、篩選最佳的小鼠胚胎體外發(fā)育培養(yǎng)體系，并進一步探討不同濃度的FBS、PVA、hLIF對其體外發(fā)育的影響，從而為小鼠卵母細胞核移植后重構(gòu)胚的體外培養(yǎng)提供支持。

2、試驗Ⅰ：分別用自配的M16、mM16、KSOM、mKSOM、CZB進行體外發(fā)育培養(yǎng)，進而篩選出一種最佳的體外培養(yǎng)體系；在篩選出培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上進行試驗Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，分別探討FBS、PVA、hLIF對小鼠胚胎發(fā)育的影響。結(jié)果，試驗Ⅰ中，受精卵培養(yǎng)效果最好的培養(yǎng)液為mM16，其次為mKSOM，在這兩種培養(yǎng)液中，胚胎發(fā)育到4-細胞的比率分別為94.7％(91/96)和85.8.％(73/85)，發(fā)育到桑椹胚/囊胚的比率分別為84％(80/96)和

3、81.1％(69/85)，均明顯高于其他三種培養(yǎng)液(p＜0.05)；試驗Ⅱ，用5％FBS、10％FBS或15％FBS代替mM16中的BSA時，胚胎發(fā)育至桑椹胚或囊胚的比率明顯下降，分別為32.6％、35.8％，與對照組(82.1％)差異顯著(p＜0.05)；試驗Ⅲ，用0.05mg/mLPVA、0.1mg/mLPVA、0.5mg/mLPVA或1mg/mLPVA取代mM16中的BSA，胚胎不能發(fā)育到桑椹胚/囊胚，與對照組差異顯著(p＜0.0

4、5)；試驗Ⅳ，三種不同濃度的hLIF均能提高胚胎在體外的發(fā)育率，但以1000IU/mL濃度的hLIF效果最好。表明在不添加其他成分前提下，只在M16中添加0.1mmol/LEDTA、0.5mmol/L?；撬?、1000IU/mLhLIF便可獲得84％的囊胚率；FBS和PVA不能有效取代mM16中的BSA。 2、采用不同的激活方法對小鼠卵母細胞進行孤雌激活研究。小鼠注射hCG13h后，采集卵母細胞并在體外培養(yǎng)4h～5h，分別采用乙醇

5、、氯化鍶、電脈沖對卵母細胞進行孤雌激活。結(jié)果顯示：乙醇對小鼠卵母細胞的孤雌激活效果最好，其次是氯化鍶，電脈沖對小鼠卵母細胞的孤雌激活效果較差；8％的乙醇激活5min，其激活率可達97.9％，隨后激活卵發(fā)育到桑椹胚/囊胚的比率為85.4％，與其他乙醇激活組差異顯著；在氯化鍶的激活組中，用2mmol/LSrCl2和5μg/mLCB處理卵母細胞1h，其激活效果最好；含有1％DMS0的氯化鍶激活組中，卵母細胞的激活率普遍高于含5μg/mLCB的

6、氯化鍶激活組，差異顯著(P＜0.05)，但隨后激活卵發(fā)育到桑椹胚或囊胚的比率明顯低于含5μg/mlLCB的氯化鍶激活組，差異極顯著(P＜0.01)；電脈沖對小鼠卵母細胞激活率和隨后激活卵的發(fā)育率普遍都較低，其中以場強為2.0kv/cm，持續(xù)時間160μs,連續(xù)兩次激活效果較好，卵母細胞的激活率及隨后囊胚發(fā)育率分別為64.5％和37.5％與其他電脈沖激活組差異顯著(P＜0.05)。表明8％乙醇激活的小鼠卵母細胞有較強的體外發(fā)育能力。

7、 3、分別采用“盲吸法”、“點擊法”、“負壓-點壓法”三種不同的方法對MII期小鼠卵母細胞進行去核，并初步探討了卵母細胞采集時間、操作液中添加不同濃度的蔗糖以及操作時的溫度對小鼠卵母細胞去核的影響。其結(jié)果顯示卵母細胞在hCG注射后12.5h采集，此時有67.1％的卵母細胞核紡錘體位于第一極體的下方，與其他時間段采集效果差異顯著(P＜0.05)；在操作液中添加3％的蔗糖，在普通倒置顯微鏡下可以較清楚的顯示卵母細胞的核區(qū)；操作環(huán)境溫度過高