牛卵母細(xì)胞冷凍保存與體外孤雌培養(yǎng)技術(shù)研究.pdf

1、隨著體外受精-胚胎移植（Invitro fertilization embryo transplantation， IVF-ET）和冷凍技術(shù)的發(fā)展，冷凍技術(shù)在動物種質(zhì)資源的保存上得以推廣應(yīng)用，雖然卵母細(xì)胞的冷凍方法在不斷發(fā)展，但是由于冷凍后受到一定的損傷，對其后的發(fā)育會產(chǎn)生一定的影響。尤其是卵母細(xì)胞在冷凍后，再進(jìn)行孤雌培養(yǎng)是充分利用卵母細(xì)胞的一個重要部分。這對充分利用屠宰場里大量的荷斯坦牛卵母細(xì)胞有一定幫助。本研究探討了冷凍后卵母細(xì)胞的

2、成熟與孤雌激活，以及冷凍處理對孤雌激活的影響。 本研究分為三個實(shí)驗(yàn)，研究結(jié)果如下: 試驗(yàn)一: 不同冷凍方法對牛卵母細(xì)胞體外成熟及孤雌胚發(fā)育的影響。 1.冷凍后卵母細(xì)胞形態(tài)正常率、卵裂率、囊胚率與對照組差異極顯著（P<0.01），卵裂率及囊胚率小于對照組，說明冷凍處理對卵母細(xì)胞有一定的損傷，對卵母細(xì)胞后續(xù)的激活，培養(yǎng)均有一定的影響。本研究觀察到，麥管法與OPS法差異極顯著（P<0.01），OPS法冷凍的卵母細(xì)胞形態(tài)

3、正常率、卵裂率、囊胚率均顯著比麥管法冷凍要高，說明OPS法可以有效地保護(hù)卵母細(xì)胞，保證其后孤雌激活，冷凍程序?qū)β涯讣?xì)胞造成的影響較小（P>0.05）。 2.冷凍后卵母細(xì)胞形態(tài)正常率、卵裂率、囊胚率與對照組相比，差異極顯著（P<0.01）。而保護(hù)劑1與保護(hù)劑2之間差異不顯著，但保護(hù)劑2比保護(hù)劑1的要高，說明保護(hù)劑2對牛卵母細(xì)胞的保護(hù)能力比保護(hù)劑1效果要好，而保護(hù)劑1的卵母細(xì)胞卵裂率要略高與保護(hù)劑2 （P>0.05）。 3.

4、OPS法平衡溫度38℃與25℃相比，差異不顯著。在38℃時，卵母細(xì)胞形態(tài)正常率、卵裂率、囊胚率均略高于25℃。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在38℃與25℃之間平衡溫度，對冷凍后卵母細(xì)胞孤雌發(fā)育的影響不大。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，38℃、25℃時與4℃相比，差異極顯著，當(dāng)平衡溫度明顯降低后，會對卵母細(xì)胞的孤雌發(fā)育造成顯著的影響，平衡溫度不宜低于25℃。在4℃時，冷凍后的卵母細(xì)胞激活后出現(xiàn)囊胚，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明低溫平能溫度對孤雌發(fā)育的囊胚階段有較大影響。 試驗(yàn)二

5、: 不同培養(yǎng)條件對牛卵母細(xì)胞體外成熟及孤雌胚發(fā)育的影響。 1.在成熟培養(yǎng)液中添加不同濃度卵泡液，發(fā)現(xiàn)：添加0％-20％的卵泡液，對卵母細(xì)胞孤雌激活后的卵裂率沒有明顯影響（P>0.05）；添加10％，20％的卵泡液卵母細(xì)胞孤雌激活后，囊胚發(fā)育率（14.6％，14.8％）明顯高于添加5％和0％組（10.9％，11.4％，P<0.05），結(jié)果表明，在成熟培養(yǎng)液中添加10％， 20％卵泡液對卵母細(xì)胞的成熟與隨后的囊胚發(fā)育有促進(jìn)作用。

6、 2.本試驗(yàn)分別用三蒸水和Mill-Q超純水配制的培養(yǎng)液培養(yǎng)牛孤雌激活胚胎，結(jié)果表明，卵母細(xì)胞成熟率（PbI排放率）和卵裂率及囊胚率等無顯著影響（P>0.05）。水并不是影響孤雌激活胚胎發(fā)育的關(guān)鍵因素，只要水質(zhì)干凈，符合培養(yǎng)用水就不會給隨后的培養(yǎng)造成較大影響。 試驗(yàn)三: 不同作用時間對牛卵母細(xì)胞體外成熟及孤雌胚發(fā)育的影響。 1.試驗(yàn)結(jié)果表明，體外成熟24 h-30 h的卵母細(xì)胞，激活后卵裂率差異不顯著（P>0.05）

7、，但隨著成熟時間延長，卵裂率有上升趨勢。卵母細(xì)胞成熟28 h或30 h囊胚的發(fā)育率為（16.4％， 15.3％）明顯高于成熟24 h或26 h的囊胚發(fā)育率（10.5％， 9.8％.P<0.05）。卵母細(xì)胞隨著成熟時間的延長，卵母細(xì)胞得到較為充分的成熟過程，成熟卵母細(xì)胞數(shù)量就會增多，這可能就是卵母細(xì)胞激活后囊胚率提高的另一個因素。 2.本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證實(shí)，牛成熟卵母細(xì)胞用離子霉素激活5 min，再用6-DMAP激活2h，卵裂率顯著

8、低于激活4h，6h組（P<0.05），6-DMAP作用時間為4h或6h的囊胚發(fā)育率明顯高作用于2h或8h的囊胚發(fā)育率（P<0.05）。結(jié)果表明，卵母細(xì)胞成熟28 h后，用5 um ionomycin培養(yǎng)液激活5 min，然后在含有2mM在6-DMAP的培養(yǎng)液培養(yǎng)4h-6h為宜。激活4h與6-DMAP激活時間6h相比差異不顯著。6-DMAP作用時間為8h，囊胚發(fā)育率有下降趨勢。表明6-DMAP作用時間對牛成熟卵母細(xì)胞的激活效率有影響。本試