DDRT-PCR技術(shù)分析甜菜鹽脅迫相關(guān)基因差.pdf

1、影響作物產(chǎn)量的因素眾多,其中主要問題之一是土壤鹽漬化,并且土壤鹽漬化目前有明顯的嚴(yán)重和擴(kuò)大趨勢。甜菜在全世界很多地區(qū)均有種植,是重要的產(chǎn)糖經(jīng)濟(jì)作物。相對于其他作物,甜菜具有較好的耐鹽堿性。研究甜菜耐鹽性,進(jìn)一步從分子水平上認(rèn)識甜菜耐鹽堿機(jī)理,發(fā)現(xiàn)并得到更多的甜菜耐鹽基因,有利于對于提高栽培甜菜及其他植物的耐鹽性、豐富耐鹽基因資源意義重大。
　　本研究以耐鹽甜菜品系“O”68為材料,經(jīng)高鹽(300mM濃度NaCl)處理后利用改進(jìn)的D

2、DRT-PCR技術(shù)和銀染技術(shù)對在正常條件下與高鹽條件下甜菜葉片進(jìn)行不同處理?xiàng)l件下的mRNA差異顯示分析,以期找到有價值的耐鹽相關(guān)基因,并對這些差異表達(dá)的cDNA片段進(jìn)行克隆、測序和功能鑒定。
　　為得到甜菜高鹽誘導(dǎo)表達(dá)的基因片段,利用RNA提取試劑盒提取處理組和對照組葉片總RNA,利用瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性并利用分光光度計(jì)檢測RNA樣品的純度后,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以cDNA為模板,利用26條隨機(jī)引物與3條錨定引物Oligo(d

3、T)10G(C或A)組合成78對引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物利用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測并采取銀染法顯色。共獲得擴(kuò)增條帶一千余條,差異條帶50條,其中上調(diào)15條,下調(diào)35條,選取差異片段回收并進(jìn)行二次擴(kuò)增,對回收的片段利用Northern雜交驗(yàn)證,陽性結(jié)果進(jìn)行克隆、測序、NCBI上比對以及同源性分析,本研究共獲得12條耐鹽相關(guān)cDNA片段,涉及葉綠體mRNA及tRNA、SOS信號通路蛋白cDNA、NADH脫氫酶cDNA、硫鐵蛋白