利用DDRT-PCR技術研究AM真菌浸染紫穗槐過程中相關基因.pdf

1、叢枝菌根(arbuscular mycorrhiza,AM)是一種廣泛存在的內(nèi)生菌根,能增強植物對礦質(zhì)營養(yǎng)元素(尤其是磷元素)和水分的吸收,減緩干旱危害和保持土壤結構,促進植物的生長。AM共生過程是一個多方面參與并精細協(xié)調(diào)的信號事件,共生體系中的雙方相互識別并發(fā)生一系列復雜的形態(tài)學和生理學變化。本實驗選用木本豆科植物代表樹種紫穗槐(Amorpha fruticosa)及AMF摩西球囊霉(Glomus mosseae),利用mRNA差異顯

2、示技術研究叢枝菌根共生建立過程中的信號識別相關基因,從分子水平上對菌根共生機制、信號轉(zhuǎn)導途徑進行深入研究。該研究結果對豐富和發(fā)展共生生態(tài)學具有重要的理論意義,為更好地利用固氮樹種資源、菌根技術和提高共生固氮的效率都將產(chǎn)生重要的現(xiàn)實意義。
　　 首先,選取三種總RNA提取的方法:Biozol法、SDS／酚法、CTAB法,對侵染率分別為0％、10％、30％、50％、100％的接種AMF(arbuseular mycorrhizalf

3、ungi,AMF)與接種滅活的AMF對照處理的紫穗槐根部提取總RNA,通過測定其吸光度值計算其純度和1.1％瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整度,結果表明,在五個不同侵染率,均為Biozol法提取的總RNA純度高,質(zhì)量好,且提取時間較短僅需2-3h。將效果較好的Biozol方法提取的侵染率為0％(前期)和30％(后期)的總RNA進行純化并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。其次,用20條隨機引物和3條錨定引物擴增cDNA,PCR產(chǎn)物經(jīng)6％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分

4、離。本試驗共獲得了169條差異顯示的表達片段,前期為63條,后期106條。對169條中的30條進行反Northern雜交驗證。經(jīng)過統(tǒng)計,前期的差異片段陽性率為42％,而后期的假陽性率較高為61％,共得到12條陽性差異片段。
　　 最后,對陽性差異條帶進行克隆測序,大部分為250-500bp左右。并且已經(jīng)提交NCBI上的EST庫,其在GenBank上的序列號為:GW317173,GW327914,GW327915,GW327873

5、,GW327874,GW327875,GW327876,GW327877,GW327878,GW327879,GW327880,GW327881。同時,對12條差異片段進行Blastx比對分析,其中,DD-1與蓖麻屬的假定蛋白相似性較高,DD-2與同源域-亮氨酸拉鏈蛋白有關,調(diào)控植物特有的發(fā)育進程,以及對包括外界脅迫在內(nèi)的環(huán)境信號的應答；DD-3與ATP結合盒蛋白有關,可以幫助代謝產(chǎn)物、離子、糖、氨基酸、脂類、固醇以及藥物等多種底物通過

6、細胞內(nèi)、外膜；DD-4與阿耶羅菌屬和青霉菌屬的假定蛋白相似；DD-5與大麥的呼吸氧化酶基因相似,在菌根共生的前期階段,形成叢枝菌根時,最明顯的植物生理變化就是植物的呼吸作用增加；DD-7與黃桿菌屬的基因組有較大的相似性；DD-8與乙酰轉(zhuǎn)移酶相關,對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和活性產(chǎn)生重大影響；DD-9與阿耶羅菌屬假定蛋白相似性較高；DD-10與苜蓿中核糖核酸酶H相似；DD-11在擬南芥中克隆的轉(zhuǎn)座子基因序列相似；DD-12與色素蛋白有關,而色素蛋白