ACSS2在非小細胞肺癌中的表達及意義.pdf

1、目的：
　　本研究擬鑒定ACSS2基因在非小細胞肺癌癌組織及正常支氣管肺組織中的表達情況，通過siRNA干擾技術(shù)抑制非小細胞肺癌A549細胞中ACSS2基因的表達，觀察通過靶向沉默ACSS2對非小細胞肺癌細胞A549體外增殖、凋亡和遷移等生物學行為的影響，探討ACSS2在非小細胞肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為ACSS2后續(xù)實驗提供新的依據(jù)，為非小細胞肺癌的診療提供新思路新策略。
　　資料與方法：
　　收集診斷明確的非小細胞肺

2、癌患者手術(shù)切除的癌組織及正常肺組織標本，通過RT-PCR方法檢測非小細胞肺癌癌組織及正常肺組織中ACSS2基因的表達情況。通過化學合成方法設計并合成ACSS2-siRNA，在脂質(zhì)體(Lipofectamine'rM2000)的介導下進行人非小細胞肺癌A549細胞轉(zhuǎn)染。采用qRT-PCR的方法檢測siRNA轉(zhuǎn)染前后A549細胞中ACSS2基因相對表達的量的變化。通過四甲基偶氮唑鹽(MTT)的方法檢測轉(zhuǎn)染ACSS2-siRNA對非小細胞肺癌

3、A549細胞增殖的影響；流式細胞術(shù)(FCM)檢測ACSS2-siRNA對細胞凋亡的影響；細胞劃痕實驗分析細胞體外遷移侵襲能力的變化。
　　結(jié)果：
　　1.非小細胞肺癌癌組織及正常肺組織中ACSS2的表達情況
　　應用RT-PCR方法檢測非小細胞肺癌癌組織及正常肺組織中ACSS2 mRNA的表達，結(jié)果顯示77％（23/30）的癌組織中ACSS2呈高表達，與正常的支氣管肺組織中ACSS2的表達情況相比差異具有統(tǒng)計學的意義（

4、P<0.05）。
　　2.轉(zhuǎn)染ACSS2-siRNA靶向沉默ACSS2 mRNA表達
　　通過脂質(zhì)體(LipofectamineTM2000)將體外合成的ACSS2-siRNA及control-siRNA(對照組)轉(zhuǎn)染入非小細胞肺癌A549細胞，然后在轉(zhuǎn)染后的72h應用qRT-PCR實驗方法檢測細胞中ACSS2基因的變化，結(jié)果表明ACSS2-siRNA可有效抑制ACSS2的表達，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　

5、　3．轉(zhuǎn)染ACSS2-siRNA對A549細胞生長的抑制作用
　　應用四甲基偶氮唑鹽(MTT)方法檢測轉(zhuǎn)染 ACSS2-siRNA、對照組siRNA后的A549細胞及空白對照組A549細胞在24、48、72、96小時細胞的生長增殖情況。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染后24h細胞生長抑制率為(8.5±5.2)％，48h細胞的生長抑制率為（17.3±3.6)％，72h細胞的生長抑制率為(22.9±4.1)％，96h細胞的生長抑制率為（29.7±6.5

6、）％。轉(zhuǎn)染后24小時實驗組細胞與對照組細胞生長抑制率無明顯統(tǒng)計學差異（P=0.06），48、72、96小時實驗組與對照組相比細胞生長抑制率有明顯差異且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0．05)，表明通過降調(diào)ACSS2可明顯抑制細胞的增殖(圖3)。
　　4．轉(zhuǎn)染ACSS2-siRNA對A549細胞凋亡的影響
　　應用流式細胞術(shù)實驗方法檢測轉(zhuǎn)染ACSS2-siRNA對A549細胞凋亡的影響，結(jié)果顯示：siACSS2轉(zhuǎn)染后48h，ACSS

7、2-siRNA轉(zhuǎn)染組較陰性對照組和空白對照組細胞早期凋亡率明顯上升。早期細胞凋亡率三組分別為（21.6±2.92）％，(5.7±2.51)％,（8.5±1.60）％。通過轉(zhuǎn)染ACSS2-siRNA的實驗組細胞早期凋亡率明顯高于陰性對照組及空白對照組細胞（P<0.05），而陰性對照組與空白對照組之間的早期凋亡率無明顯差異。這一結(jié)果說明降調(diào)ACSS2能夠促進非小細胞肺癌A549細胞發(fā)生早期凋亡（圖4）。
　　5．轉(zhuǎn)染ACSS2-siR

8、NA對A549細胞體外侵襲力的影響
　　應用細胞劃痕實驗檢測ACSS2-siRNA對細胞遷移能力的影響，結(jié)果應用Image-Pro plus6.0進行分析，分別測量0h、24h及其48h的劃痕寬度，平均遷移距離＝（0h的劃痕寬度－24h/48h的劃痕寬度）/2。24h實驗組細胞平均遷移（32.6±5.8） um，陰性對照組細胞平均遷移（44.6±8.4） um，空白對照組細胞平均遷移（42.9±8.0）um。三組之間差異無統(tǒng)計學意

9、義（P＞0.05,P=0.87）。48h實驗組細胞平均遷移（83.1±7.7）um，陰性對照組細胞平均遷移（120.3±8.3）um，空白對照組細胞平均遷移（125.5±7.6）um。實驗組與空白對照組細胞遷移距離有明顯差異，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　非小細胞肺癌癌組織中ACSS2 mRNA較正常肺組織呈明顯高表達，ACSS2-siRNA能特異性抑制ACSS2基因的表達。降調(diào)ACSS2表達可抑制非