多發(fā)性骨髓瘤患者外周血和骨髓液微泡的流式檢測(cè)及其臨床意義.pdf

1、目的:通過(guò)檢測(cè)骨髓瘤患者不同階段特異性微泡（Microvesicles, MVs）的數(shù)量及比例變化情況，掌握不同疾病狀態(tài)MVs的變化規(guī)律，為骨髓瘤診斷及預(yù)后判斷尋找新的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。
　　方法:
　　1.收集初治、緩解、復(fù)發(fā)多發(fā)性骨髓瘤患者及性別年齡匹配的健康志愿者外周血、骨髓液標(biāo)本。
　　2.差異離心法提純分離外周血及骨髓液中的MVs標(biāo)本。
　　3.透射電鏡觀察MVs的形態(tài)和大小。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MV

2、s的數(shù)量及特異性MVs的比例，分析臨床病人不同階段漿細(xì)胞來(lái)源MVs（CD38+CD138+）、內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源MVs（CD105+CD45－）及血小板來(lái)源MVs（CD41+CD105－）的構(gòu)成比。BECKMAN流式細(xì)胞儀可以清晰分辨1.0um、3.0um標(biāo)準(zhǔn)微球，最低檢測(cè)下限為200nm，應(yīng)用1.0um標(biāo)準(zhǔn)微球設(shè)定流式細(xì)胞儀FSC和SSC參數(shù)，利用3.0um標(biāo)準(zhǔn)微球作為計(jì)數(shù)內(nèi)參。我們用Calcein-AM染液標(biāo)記具有完整膜結(jié)構(gòu)的MVs，并設(shè)

3、定直徑小于1.0um為MVs。
　　5.統(tǒng)計(jì)分析MVs數(shù)量及特異性MVs的比例在健康志愿者、緩解多發(fā)性骨髓瘤患者、初治多發(fā)性骨髓瘤患者及復(fù)發(fā)多發(fā)性骨髓瘤患者之間的差異，分析評(píng)估特異性MVs比例與多發(fā)性骨髓瘤臨床特征的相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)透射電鏡觀察多發(fā)性骨髓瘤患者外周血血清來(lái)源MVs形態(tài)結(jié)構(gòu)，多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞來(lái)源的MVs在透射電鏡下觀察均為直徑0.1-1um大小不一、均質(zhì)的雙層磷脂膜包裹的囊泡狀結(jié)構(gòu)，這與目

4、前為止國(guó)內(nèi)外所報(bào)道的其他細(xì)胞分泌的MVs在形態(tài)、大小上相一致。
　　2.應(yīng)用BECKMAN流式細(xì)胞儀可以比較準(zhǔn)確計(jì)數(shù)標(biāo)本中MVs的數(shù)量。FACS結(jié)果顯示，多發(fā)性骨髓瘤患者外周血及骨髓液中MVs數(shù)量明顯高于健康對(duì)照組（P<0.05），復(fù)發(fā)患者與初治患者相比MVs數(shù)量更多（P<0.05），且初治患者M(jìn)Vs數(shù)量比高于緩解患者（P<0.05）。骨髓上清液MVs濃度明顯高于外周血上清液MVs濃度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　

5、　3.用CD38和CD138兩個(gè)表面標(biāo)記多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中漿細(xì)胞來(lái)源的MVs，多發(fā)性骨髓瘤患者外周血和骨髓液MVs中CD38+CD138+-MVs比例明顯高于健康對(duì)照組（P<0.05），復(fù)發(fā)患者CD38+CD138+-MVs比例明顯高于初治患者（P<0.05），且初治患者CD38+CD138+-MVs比例明顯高于緩解患者（P<0.05）。CD38+CD138+-MVs比例與臨床上常用提示腫瘤負(fù)荷及預(yù)后的指標(biāo)β2微球蛋白、LDH呈正相關(guān)（

6、骨髓液β2微球蛋白：r=0.601，P=0.005）（骨髓液LDH：r=0.720，P=0.000）（外周血β2微球蛋白：r=0.729，P=0.029）（外周血LDH：r=0.621，P=0.018），提示可用于檢測(cè)腫瘤預(yù)后。CD38+CD138+-MVs比例與MM分型、分期之間暫無(wú)相關(guān)性。
　　4.用CD105+CD45－來(lái)標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞分泌的MVs，用CD41+CD105－來(lái)標(biāo)記血小板分泌的MVs，多發(fā)性骨髓瘤患者外周血和骨髓

7、液MVs中內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的MVs比例（CD105+CD45－）及血小板來(lái)源MVs（CD41+CD105－）比例均明顯高于健康對(duì)照（P<0.05），復(fù)發(fā)患者內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源MVs比例及血小板來(lái)源MVs比例均明顯高于初治患者（P<0.05），且初治患者內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源MVs比例及血小板來(lái)源MVs比例均明顯高于緩解患者（P<0.05），暫未統(tǒng)計(jì)到內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的MVs（CD105+CD45－）比例及血小板來(lái)源的MVs（CD41+CD105－）比例與腫瘤負(fù)