普通小麥及其近緣種籽粒多酚氧化酶活性與黃色素含量相關(guān)基因的克隆與功能標(biāo)記開發(fā).pdf

1、顏色性狀是小麥品質(zhì)評價的重要指標(biāo)，對面制品的表觀色澤有著重要影響，研究面粉顏色性狀形成的分子機理對于小麥品質(zhì)改良具有重要意義。本研究選用217份中國冬麥區(qū)的主栽品種、342份CIMMYT春麥材料、100份CIMMYT硬粒小麥品種以及47份小麥近緣種材料，以籽粒多酚氧化酶(polyphenoloxidase，PPO)活性與黃色素含量為目標(biāo)性狀，應(yīng)用電子克隆結(jié)合PCR擴增的方法，克隆與顏色性狀緊密相關(guān)的PPO和八氫番茄紅素合成酶(Phyto

2、enesynthase，PSY)基因并分析其在不同品種中的等位變異，根據(jù)各等位基因之間的序列差異開發(fā)可用于分子標(biāo)記輔助選擇的功能標(biāo)記，并分析了這些材料基因型與表型之間的關(guān)系。 主要結(jié)果如下： 1.克隆了普通小麥2A和2D染色體上的PPO基因Ppo-A1與Ppo-D1的全長編碼序列，兩者均含有3個外顯子和2個內(nèi)含子以及一個1731bp的開放讀碼框。針對Ppo-D1位點的等位變異epo-D1a和Ppo-D1b分別開發(fā)了顯性標(biāo)

3、記PPO16和PPO29。通過對217份中國冬小麥品種的檢測，發(fā)現(xiàn)PPO16所擴增的713bp條帶與低PPO活性相關(guān)，而PPO29擴增的490bp條帶與高PPO活性相關(guān)。應(yīng)用中國春缺體-四體及雙端體材料，將PPO16定位在2DL染色體。在中優(yōu)9507/CA9632的71個DH系中，將PPO16與PPO29定位在2D染色體的長臂上，并與2DL染色體上的SSR標(biāo)記Xwmc41緊密連鎖，遺傳距離為2cM。在該DH群體中進(jìn)行QTL分析，檢測到了

4、一個與PPO16和PPO29共分離的主效QTL，在3個不同環(huán)境中可解釋9.6～24.4％的表型變異。根據(jù)Ppo-A1兩個等位變異的序列差異設(shè)計了一個共顯性標(biāo)記PPO33，可以與標(biāo)記PPO16在同一體系中擴增，構(gòu)建多重PCR體系。 2.根據(jù)普通小麥Ppo-A1和Ppo-D1的基因序列設(shè)計引物，在普通小麥的近緣種中鑒定并克隆了7個新的等位變異。其中5個來自于Ppo-A1位點，即印Ppo-A1C(來自于烏拉爾圖小麥)、Ppo-A1d(

5、野生一粒小麥)、Ppo-A1e，(栽培一粒小麥和硬粒小麥)、Ppo-A1f(野生二粒小麥)和Ppo-A1g(硬粒小麥)；2個來自于Ppo-D1位點，即印Ppo-D1c和Ppo-A1d(均來自于粗山羊草)。這7個新等位變異與普通小麥中的4個等位變異具有相似的基因結(jié)構(gòu)，即均含有3個外顯子和2個內(nèi)含子，并且除Ppo-A1g和Ppo-D1d以外的9個等位變異都含有一個1731bp的開放讀碼框，編碼577個氨基酸的多肽鏈。Ppo-A1g的下游序列

6、在本實驗中沒有克隆到；在Ppo-D1d的第三外顯子處有一段73bp缺失，導(dǎo)致移碼突變和翻譯提前終止，產(chǎn)生一段較短的466個氨基酸的多肽序列。 3.以玉米八氫番茄紅素合成酶(Phytoenesynthase，PSY)基因PSY1的mRNA序列為探針，獲得了普通小麥7A染色體上PSY1基因Psy-A1的全長序列。Psy-A1的基因組DNA序列由4175個堿基對組成，包括6個外顯子和5個內(nèi)含子，以及部分5’和3’非翻譯區(qū)，并含有一個1

7、284bp的開放讀碼框，編碼一段428個氨基酸殘基的多肽鏈。在217份中國冬麥材料和342份CIMMYT春麥材料中發(fā)現(xiàn)了Psy-A1的3個等位變異，Psy-A1a、Psy-A1b和Psy-A1C根據(jù)Psy-A1a和Psy-A1b以及Psy-A1a和Psy-A1c的序列差異分別開發(fā)了共顯性標(biāo)記YP7A和YP7A-2。YP7A在Psy-A1a口類型材料中的194bp擴增片段與高黃色素含量相關(guān)，而在Psy-A1b材料中擴增的231bp片段則與

8、低黃色素含量相關(guān)。在RLL群體PH82-2/內(nèi)鄉(xiāng)188中，YP7A被定位于7AL染色體，與SSR標(biāo)記Xwmc809連鎖，遺傳距離為5.8cM。將一個控制黃色素含量的主效QTL定位在這一區(qū)段上，并與YP7A共分離，在不同環(huán)境中可以解釋20.0～28.0％的表型變異。 4.參照Psy-A1的序列特征并結(jié)合電子克隆方法，在217份中國冬麥材料和342份CLMMYT春麥材料中鑒定并克隆了7B染色體Psy-B1位點的5個等位變異，即Psy

9、-B1a、Psy-B1b、Psy-B1c、Psa-B1d和Psy-B1e。其中Psy-B1a、Psy-B1b和Psy-B1c在中國冬麥材料中的比例分別為39.6％、43.8％和15.7％；Psy-B1a、Psy-B1b和Psd-B1d在CIMMYT春麥材料中的比例分別為50.6％、29.2％和19.6％；而Psy-B1d和Psy-B1e在中國冬麥材料和CIMMYT春麥材料中只分別檢測到2例。根據(jù)Psy-B1a和Psy-B1b的序列多態(tài)性

10、開發(fā)了共顯性標(biāo)記YP7B-1其在Psy-B1a材料中擴增的151bp片段與高黃色素含量相關(guān)，而在Psy-B1b中擴增的156bp的片段則與低黃色素含量相關(guān)。根據(jù)Psy-B1c的特異序列開發(fā)了顯性標(biāo)記YP7B-2，其428bp的擴增片段與高黃色素含量相關(guān)。根據(jù)Psy-B1d和Psy-B1e的序列分別設(shè)計了顯性標(biāo)記YP7B-3和YP7B-4，可分別擴增出884bp和717bp的片段。用標(biāo)記YP7A、YP7B-1和YP7B-2檢測217份中國

11、冬麥材料，表明不同基因型的黃色素含量差異達(dá)到1％顯著水平。在這個基礎(chǔ)上，再結(jié)合1B-1R易位系的檢測，則可在更大程度上提高基因型和表型的吻合程度。然而，基于Psy-B1基因開發(fā)的分子標(biāo)記在CIMMYT春麥材料中卻沒有表現(xiàn)出與表型性狀的顯著相關(guān)，進(jìn)一步分析顯示這些材料的黃色素含量主要受Psy-A1和1B-1R兩個位點的調(diào)控，應(yīng)用這兩個位點的分子標(biāo)記即可對黃色素含量做出比較準(zhǔn)確的預(yù)測。 5.在硬粒小麥7A染色體Psy-A1位點鑒定并

12、克隆了Psy-A1d和Psy-A1e的全序列，可以用標(biāo)記YP7A或YP7A-2來區(qū)分；在硬粒小麥7B染色體Psy-B1位點鑒定并克隆了Psy-B1e、Psy-B1f和Psy-B1g的全序列，其中Psy-B1e為普通小麥和硬粒小麥共有，其它兩個為硬粒小麥特有。等位變異Psy-B1f和Psy-B1g可以用共顯性標(biāo)記YP7B-1區(qū)分，Psy-B1e可以用顯性標(biāo)記YP7B-4檢測。通過對100份CIMMYT硬粒小麥材料的檢測，發(fā)現(xiàn)YP7B-1在

13、Psy-B1f中擴增的151bp片段與高黃色素含量相關(guān)，而在Psy-B1g材料中擴增的153bp片段與低黃色素含量相關(guān)。 6.應(yīng)用本文克隆到的PPO和PSY1基因的等位基因序列分別構(gòu)建了兩個系統(tǒng)發(fā)育樹。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，并參考各個等位變異的序列特征，分析了普通小麥及其近緣種Ppo-A1、Psy-A1和Psy-B1位點各等位變異的進(jìn)化關(guān)系，認(rèn)為普通小麥有2個或2個以上四倍體祖先：分析了ppD-D1位點等位變異，認(rèn)為普通小麥