普通小麥脂肪氧化酶活性及其基因克隆與功能分析.pdf

1、面粉色澤是最重要的小麥品質(zhì)性狀之一，對面條、饅頭及其它食品品質(zhì)有重要影響。脂肪氧化酶（Lipoxygenase，簡稱Lox）是影響面粉色澤的重要因素，現(xiàn)已成為小麥品質(zhì)育種的重要目標(biāo)之一。改良 Lox活性有助于改善面制品的色澤、面粉的加工品質(zhì)以及延長種子的儲(chǔ)藏時(shí)間等，研究 Lox基因的分子遺傳機(jī)理對我國小麥品質(zhì)改良具有重要意義。本研究以咸陽83104/周麥16的110份重組近交系（RIL）和163份黃淮海麥區(qū)的主栽品種和高代品系為材料，采

2、用電子克隆技術(shù)、分光光度計(jì)法、熒光定量PCR、RNA干擾、基因遺傳轉(zhuǎn)化、普通 PCR擴(kuò)增、酶切、分子克隆和 DNA測序等技術(shù)以及根據(jù)不同基因或等位變異間序列差異開發(fā)STS功能標(biāo)記對參試材料的Lox活性及基因型進(jìn)行了鑒定，并對163份品種（系）的面粉色澤及部分品質(zhì)性狀進(jìn)行了測試，主要結(jié)果如下：
　　1.黃淮海地區(qū)的冬小麥品種（系）籽粒以中等Lox活性為主，不同品種（系）間籽粒Lox活性存在較大差異，變異范圍為49.13-110.77

3、 A234 min?1g?1，具有較大的選擇潛力。對來自黃淮麥區(qū)的163份不同遺傳背景的普通小麥冬品種（系）Lox活性在不同環(huán)境條件下的方差分析表明，不同年份、不同地點(diǎn)間的Lox活性存在顯著性差異，籽粒Lox活性的廣義遺傳力為0.75，基因型與環(huán)境互作效應(yīng)對Lox活性均有顯著影響，而基因型效應(yīng)對籽粒Lox活性的影響最大。小麥籽粒Lox活性除影響面粉色澤外，對其它品質(zhì)性狀也具有一定影響。Lox活性與面粉白度呈顯著負(fù)相關(guān)，與面粉黃度呈顯著正

4、相關(guān)，而與蛋白質(zhì)含量、籽粒硬度、濕面筋含量等品質(zhì)性狀相關(guān)但不顯著。該研究為進(jìn)一步了解小麥籽粒 Lox活性與面粉色澤及其它品質(zhì)性狀的關(guān)系具有一定的參考價(jià)值。
　　2.利用電子克隆技術(shù)克隆了普通小麥4BS染色體上的TaLox-B2和 TaLox-B3基因。TaLox-B2基因的gDNA序列全長4267 bp，TaLox-B3基因的gDNA序列全長4246 bp，它們在DNA水平上的相似性達(dá)到了84.8％。TaLox-B2和TaLox-

5、B3基因均含有7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子，其cDNA全長均為2586 bp，編碼一段含有861個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈。氨基酸序列分析表明，TaLox-B2與TaLox-B3基因的相似性高達(dá)97.8%，且預(yù)測在170-838處存在一個(gè)與蛋白穩(wěn)定性維持相關(guān)的Lox基因家族中較為保守的結(jié)構(gòu)域。
　　3.發(fā)現(xiàn) TaLox-B2基因在我國冬小麥品種中存在有兩種等位變異 TaLox-B2a和TaLox-B2b，依據(jù)其基因組序列與TaLox-B3基因

6、序列間差異，開發(fā)了共顯性功能標(biāo)記Lox-B23。在TaLox-B2a和TaLox-B3類型的材料中分別擴(kuò)增出788 bp和677 bp片段，與高Lox活性相關(guān)，在TaLox-B2b的材料中擴(kuò)增出660 bp片段，與低Lox活性相關(guān)。參試材料中共發(fā)現(xiàn)4BS染色體的TaLox-B1、TaLox-B2和 TaLox-B3位點(diǎn)上的5種等位變異組合，其中TaLox-B1a/TaLox-B2a/TaLox-B3a組合類型的Lox活性最高，為75.4

7、1 A234 min?1g?1， TaLox-B1a/TaLox-B2b/TaLox-B3b組合類型的Lox活性最低，為72.25 A234 min?1g?1。利用中國春的缺體-四體系將Lox-B23標(biāo)記也定位于普通小麥4BS染色體上。同時(shí)，利用咸陽83104/周麥16和構(gòu)建的RIL群體進(jìn)一步明確 TaLox-B3基因與籽粒 Lox活性的關(guān)系，結(jié)果表明TaLox-B3基因能顯著增加小麥籽粒Lox活性。
　　4.對 TaLox-B2

8、與 TaLox-B3基因在小麥不同組織器官、不同逆境條件下以及籽粒發(fā)育不同時(shí)期的相對表達(dá)水平進(jìn)行RT-PCR分析，結(jié)果表明TaLox-B2（TaLox-B2a或TaLox-B2b）和TaLox-B3（TaLox-B3a）基因在普通小麥的根、莖和葉均表達(dá)，其中TaLox-B2基因主要在葉中表達(dá)，而TaLox-B3基因主要在根中表達(dá)。TaLox-B2a和TaLox-B3基因在4℃低溫、42℃高溫、NaCl脅迫以及PEG6000等逆境條件中表

9、達(dá)趨勢明顯不同，但是它們在葉中的相對表達(dá)水平受NaCl脅迫和溫度的變化影響較為明顯。此外，TaLox-B2a和TaLox-B3基因在小麥開花后7天的籽粒中的相對表達(dá)量水平最高，之后均呈下降趨勢，但二者的變化趨勢存在很大差異，說明不同Lox基因在小麥籽粒發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)趨勢明顯不同。
　　5.對控制小麥籽粒Lox活性的TaLox-B1基因進(jìn)行沉默，構(gòu)建RNAi表達(dá)載體并在小麥中進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，結(jié)果表明基因槍轟擊1690個(gè)幼胚愈傷組織

10、，最終鑒定得到21棵轉(zhuǎn)基因植株，平均轉(zhuǎn)化率較低，僅為1.2%，且發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株籽粒Lox活性相比對照株系（野生型）的顯著降低，說明TaLox-B1基因的表達(dá)產(chǎn)物的缺失導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因株系籽粒Lox活性降低。此外，轉(zhuǎn)基因植株幼苗的大小，葉片數(shù)以及分蘗數(shù)都少于對照株系，說明通過RNAi技術(shù)干擾內(nèi)源TaLox-B1基因不僅導(dǎo)致小麥籽粒Lox活性顯著下降，而且促使其農(nóng)藝性狀發(fā)生變化。RT-PCR結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因小麥植株的TaLox-B1基因的表達(dá)水平