小鼠白細胞介素17A原核表達系統(tǒng)的構建.pdf

1、目的：
　　 白細胞介素17（interleukin-17，IL-17）是近年來新發(fā)現(xiàn)的炎性細胞因子，具有多種生物學活性，是某些疾病發(fā)生和發(fā)展的重要因素之一，受到了人們的廣泛關注。IL-17是一種主要由T細胞產生，通過表達與許多細胞上的受體發(fā)揮作用的蛋白質。人IL-17是一種同源二聚多肽，主要由活化CD4+記憶T細胞分泌產生。小鼠IL-17的總長度為158個氨基酸殘基，其中21個氨基酸殘基組成其前導信號序列。人IL-17與小鼠I

2、L-17在氨基酸殘基序列上有62.5％的相似性，與大鼠IL-17有58％的相似性。國內外的實驗證實，IL-17在多種神經系統(tǒng)疾病中都有高表達。多發(fā)性硬化（multipie sclerosis，MS）患者體內IL-17表達水平增高，并且與疾病的嚴重程度有一定聯(lián)系。IL-17A是IL-17家族中最主要的成員，參與免疫介導的炎癥損傷，在全身炎癥反應中發(fā)揮重要作用。如果能夠制備出針對IL-17A的特異性抗體，并且在實驗中證實此特異性抗體可以表現(xiàn)

3、出突出的治療效果，那么不但對于臨床治療多發(fā)性硬化提供一個新的治療方向，更可能實現(xiàn)其在神經系統(tǒng)疾病中的廣泛應用。
　　 方法：
　　 本課題首先根據(jù)Genbank中小鼠IL-17A基因組序列，設計出針對小鼠IL-17A的引物，從提取的小鼠基因組中，利用PCR方法采用高保真DNA聚合酶使小鼠IL-17A基因片段大量復制擴增，片段長度為631bp，擴增片段為平滑末端，再與脫氧三磷酸腺苷相連接，將連接后的基因片段再與T克隆載體p

4、MD19-T相連接，得到含有小鼠IL-17A基因片段的pMD19-T（+）/mIL-17A重組質粒，利用重組質粒對大腸埃希氏菌DH5α感受態(tài)細胞進行轉化，并對經氨芐青霉素和指示培養(yǎng)基上藍白斑篩選的陽性重組質粒分別進行PCR檢測、雙酶切檢測和測序檢測。雙酶切檢測結果較為理想的重組質粒，同時雙酶切消化表達載體pET32a（+），將純化后的目的片段相連接，得到重組表達載體pET32a（+）/mIL-17A，轉化大腸埃希氏菌表達菌BL21（DE

5、3），37℃，1mMIPTG，200rpm誘導目的蛋白在大腸埃希氏菌BL21（DE3）中表達。
　　 結果：
　　 經SDS PAGE凝膠電泳和Western免疫印記檢測后，有融合蛋白表達，分子量約53kDa，與預期的蛋白分子量大?。?2.8kDa）基本一致，并且小鼠IL-17A融合蛋白大部分以可溶形式在大腸埃希氏菌BL21（DE3）中表達。
　　 結論
　　 實驗結果證實，重組質粒pET32a（+）/小