提高甘氨酸甜菜堿含量的轉(zhuǎn)基因小麥的抗逆性分析.pdf

1、干熱風(fēng)和干旱是限制小麥產(chǎn)量的最重要的非生物逆境因子。干熱風(fēng)是低濕、高溫和風(fēng)力共脅迫的災(zāi)害氣候，而水資源短缺更是公認(rèn)的全球性環(huán)境問題之一。長期以來，國內(nèi)外對如何提高小麥的抗干熱風(fēng)和抗旱能力開展了廣泛而深入的研究。隨著植物基因工程的發(fā)展以及大量抗逆基因的鑒定和克隆，利用基因工程方法培育抗逆作物新品種已成為減輕逆境脅迫的重要手段。
　　 小麥分布廣、種植面積大，需求量與供應(yīng)量之間的矛盾卻隨著自然環(huán)境惡化和人口增長愈來愈突出?；蚬こ碳?/p>

2、術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，為培育抗逆小麥品種及增加小麥產(chǎn)量開辟了新途徑。但由于小麥基因組大、離體培養(yǎng)受基因型的影響大等原因，利用基因工程技術(shù)改良小麥的抗逆性研究遠(yuǎn)落后于其它主要農(nóng)作物。因此，小麥抗逆基因工程研究具有重要意義。
　　 本論文以本實(shí)驗(yàn)室已得到的轉(zhuǎn)甘氨酸甜菜堿合成途徑的酶基因（來自大腸桿菌的編碼膽堿脫氫酶基因betA、來自嗜鹽藻青菌的甘氨酸肌氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因ApGSMT2和二甲基甘氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因ApDMT2)的小麥為材料，

3、開展轉(zhuǎn)基因小麥抗干熱風(fēng)和抗旱性研究。
　　 一、轉(zhuǎn)betA基因小麥的千熱風(fēng)抗性分析
　　 選取來自濟(jì)南17的轉(zhuǎn)beta基因純合株系BLI、BL2、BL3及其未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩晗?，于灌漿期模擬干熱風(fēng)脅迫處理3天，然后恢復(fù)自然條件。脅迫處理后，轉(zhuǎn)基因株系植株整體長勢較好，旗葉青枯失水較少，與野生型相比甜菜堿含量明顯較高。
　　 生理測定結(jié)果顯示：干熱風(fēng)脅迫下各株系葉綠素含量都降低，但轉(zhuǎn)基因株系的葉綠素含量始終高于野生型的

4、。干熱風(fēng)脅迫抑制了所有植株的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率：然而轉(zhuǎn)基因植株的受抑制程度明顯低于野生型的。在測定過程中，旗葉溫度不斷升高，但轉(zhuǎn)基因株系的旗葉溫度明顯低于未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩晗档?，這有利于維持較高的灌漿速率。與未轉(zhuǎn)基因植株相比，轉(zhuǎn)基因株系的最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)在處理后仍然維持在一個(gè)較高的水平。干熱風(fēng)脅迫處理3天后，轉(zhuǎn)基因株系旗葉的蔗糖磷酸合成酶(sPs)與蔗糖合成酶(SS)的活性明顯高于野生型對照。這些結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因株系在

5、干熱風(fēng)脅迫處理中能合成較多的碳水化合物，能更好地維持灌漿速率。這與旗葉中可溶性總糖和蔗糖含量的測定結(jié)果一致。
　　 與未處理組相比，干熱風(fēng)處理3天后各株系株高沒有明顯變化，穗長和穗粒數(shù)略有降低。脅迫處理后植株發(fā)生青枯、旗葉持綠面積減小，但轉(zhuǎn)基因植株的旗葉持綠面積要顯著大于未轉(zhuǎn)基因的。干熱風(fēng)處理組的百粒重、株粒重均大幅下降，其中株系BL2、BL3與野生型相比差異達(dá)到顯著性或極顯著性水平，即轉(zhuǎn)betA基因植株表現(xiàn)出顯著提高的抗干熱風(fēng)

6、特性。
　　 二、轉(zhuǎn)ApGSMT2和ApDMT2基因小麥的抗旱性分析
　　 將除草劑篩選和PCR檢測為陽性的轉(zhuǎn)pGSMT2和ApDMT2基因的T2代種子和野生型（濟(jì)麥19）的種子分別播到蛭石盤中，待小苗長到3-4葉期時(shí)進(jìn)行除草劑抗性（選擇標(biāo)記基因?yàn)閑psp，編碼的酶抗除草劑草甘膦）篩選，統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)基因株系中除草劑抗性植株的比例，根據(jù)卡方(x2)檢驗(yàn)推定外源基因在轉(zhuǎn)基因植株中的遺傳行為是否符合孟德爾分離規(guī)律。在得到的21個(gè)T2

7、代轉(zhuǎn)基因株系中，外源基因均穩(wěn)定存在。對除草劑篩選后的植株進(jìn)行PCR和RT-PCR檢測。大部分除草劑抗性植株的PCR結(jié)果為陽性，RT-PCR檢測結(jié)果表明目的基因pGSMT2和ApDMT2在不同株系中的表達(dá)強(qiáng)度有差異，表達(dá)量最高的株系為AL6。
　　 苗期是小麥對缺水較敏感的時(shí)期，此階段受到干旱脅迫會使小麥的分蘗能力下降，從而影響產(chǎn)量。選取目的基因表達(dá)量高的3個(gè)T2代轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)L1、AL4、AL6和野生型(濟(jì)麥19)進(jìn)行苗期持續(xù)干

8、旱處理，觀測植株生長狀態(tài)并測定目的基因表達(dá)量和甘氨酸甜菜堿含量、相對含水量、光合速率等生理指標(biāo)，確定轉(zhuǎn)基因株系是否具有較高的抗旱性。
　　 測定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株在干旱處理中長勢較好，分蘗數(shù)多；嚴(yán)重干旱脅迫時(shí)發(fā)生永久性萎蔫較晚，復(fù)水后存活率高且能夠較快恢復(fù)生長。在適度干旱處理中，轉(zhuǎn)基因株系的目的基因表達(dá)豐度隨著脅迫時(shí)間的延長而升高，甘氨酸甜菜堿積累水平也大幅度提高，兩者呈顯著的正相關(guān)，即目的基因表達(dá)強(qiáng)度高的株系甘氨酸甜菜堿含量

9、也較高。
　　 5葉期小麥幼苗持續(xù)干旱7天后，野生型植株失水嚴(yán)重，葉片萎蔫；而轉(zhuǎn)基因植株葉片萎蔫程度低，相對含水量較高。并且，轉(zhuǎn)基因株系的葉片細(xì)胞離子滲漏率和MDA含量均顯著低于野生型的，即轉(zhuǎn)基因株系的細(xì)胞膜損傷和膜脂過氧化程度較輕。細(xì)胞中較多可溶性物質(zhì)的積累有利于細(xì)胞吸水和維持正常的膨壓。干旱脅迫使得所有株系葉片的細(xì)胞可溶性糖和游離氨基酸含量升高，而轉(zhuǎn)基因植株可溶性糖和脯氨酸的積累量顯著高于野生型的。干旱脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因株系

10、的葉綠素含量、凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率均高于野生型的，其中株系A(chǔ)L6與野生型相比達(dá)到差異顯著水平。光化學(xué)系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)的活性測定表明轉(zhuǎn)基因株系小苗PSⅡ復(fù)合體受傷害程度較輕。這些結(jié)果表明，轉(zhuǎn)ApGSMT2和ApDMT2基因小麥具有比野生型對照明顯提高的耐旱性。
　　 由于ApGSMT2和ApDMT2催化以甘氨酸為底物合成甘氨酸甜菜堿的代謝反應(yīng)，分析干旱處理前后植株的氨基酸含量變化有助于評估基因的應(yīng)用價(jià)值。干旱處理后，干旱

11、處理后，絲氨酸含量在所有株系中均有升高，但野生型植株中升高幅度大，轉(zhuǎn)基因株系升高幅度小，且含量明顯低于野生型的；野生型植株中甘氨酸含量升高，轉(zhuǎn)基因株系均有下降且含量與野生型相比差異極顯著。這表明在轉(zhuǎn)基因株系中有大量的甘氨酸用于甘氨酸甜菜堿合成，由絲氨酸合成甘氨酸的速率也相應(yīng)提高。甘氨酸是植物體內(nèi)能夠合成且大量存在的一種氨基酸，相對于以膽堿為底物合成甘氨酸甜菜堿的途徑，這條途徑受底物濃度制約較小，這種優(yōu)勢無疑會促進(jìn)利用該代謝途徑的基因工程