鱘魚性腺潰爛病和腫嘴病病原菌分離鑒定與防治藥物篩選.pdf

1、自20世紀(jì)90年代中國開展鱘魚人工養(yǎng)殖以來，涉及鱘魚品種較多，養(yǎng)殖產(chǎn)量也位居世界首位，在全世界鱘魚養(yǎng)殖業(yè)占有重要的地位。特別是近年來，鱘魚商品形式呈現(xiàn)多樣化，鱘魚養(yǎng)殖具有巨大的市場前景。但是因鱘魚在國內(nèi)養(yǎng)殖起步較晚，養(yǎng)殖技術(shù)特別是魚病防治技術(shù)跟不上養(yǎng)殖生產(chǎn)需要，在鱘魚人工養(yǎng)殖過程中常出現(xiàn)重大細(xì)菌性疾病，引起較大經(jīng)濟(jì)損失。因此開展鱘魚重大細(xì)菌性疾病的研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究通過流行病學(xué)調(diào)查總結(jié)鱘魚養(yǎng)殖生產(chǎn)中的重大細(xì)菌性疾病，通過對導(dǎo)

2、致其發(fā)病生物因素及非生物因素進(jìn)行分析，以確定其發(fā)病機(jī)制；通過分離純化鑒定及回歸感染確定病原后篩選出有效抗菌藥物用于疾病防治，結(jié)合發(fā)病環(huán)境因素確定疾病防治方案。本次研究的主要結(jié)果如下：
　　1西伯利亞鱘性腺潰爛病病原分離鑒定及藥敏特性研究
　　從已經(jīng)患病瀕臨死亡的西伯利亞鱘的肝臟、腎臟以及性腺等組織器官上均分離到2株高致病性的菌株HD0923及HD0824，感染該病原菌后的西伯利亞鱘表現(xiàn)為生殖孔潰爛，脾臟發(fā)黑，性腺有點(diǎn)狀出血，

3、繼而發(fā)生嚴(yán)重潰爛。分離到的菌株經(jīng)純化后，通過常規(guī)生理生化鑒定，結(jié)果表明菌株HD0923可能是魯氏耶爾森氏菌，非發(fā)酵型需氧，革蘭氏陰性短桿菌，在5％綿羊血平板上不產(chǎn)生溶血現(xiàn)象；菌株HD0824為革蘭氏陰性桿，無芽孢和莢膜，在兔血平板上能形成明顯的β-溶血，蛋白酶活性很強(qiáng)。對分離株HD0923和菌株HD0824的16S rDNA基因片段序列通過PCR基因擴(kuò)增手段與測定核苷酸排列順序分析方法，并與NCBI中收錄的16S rDNA基因序列進(jìn)行同

4、源性比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明分離株HD0923的16S rDNA基因序列與NCBI中收錄的魯氏耶爾森氏菌的16S rDNA基因序列同源性為100%，在系統(tǒng)進(jìn)化樹上與魯氏耶爾森氏菌聚為一簇，進(jìn)一步確定分離到的菌株HD0923為魯氏耶爾森氏菌；分離病原菌HD0824被確定是嗜水氣單胞菌，與嗜水氣單胞菌同源性達(dá)99%。而從人工感染后發(fā)病西伯利亞鱘的肝組織、腎組織以及性腺組織再人工純化到此2株致病性菌株，由此可以確定魯氏耶爾森氏菌及嗜水

5、氣單胞菌是西伯利亞鱘此病的致病菌。分離株HD0923強(qiáng)力霉素、丁胺卡那霉素、氟苯尼考、鏈霉素、先鋒霉素V、阿莫西林、阿奇霉素、左氧氟沙星、痢特靈、慶大霉素10種藥物高度敏感，對紅霉素、氯霉素、頭孢噻肟、利福平、新霉素5種藥物中等敏感；分離菌株HD0824對慶大霉素、強(qiáng)力霉素、氯霉素、丁胺卡那霉素、氟苯尼考、頭孢噻肟、阿奇霉素及左氧氟沙星8種藥物高度敏感，對新霉素中度敏感。
　　2鱘源弗氏檸檬酸桿菌分離鑒定及藥敏特性研究
　　

6、從患鱘魚腫嘴病的施氏鱘的體內(nèi)分離純化到2株優(yōu)勢菌，分別命名為HD0102及HD0103。分別經(jīng)人工感染后，注射菌株HD0103的試驗(yàn)用施氏鱘出現(xiàn)死亡，經(jīng)診斷與自然發(fā)病死亡癥狀相似，確定菌株HD0103為鱘魚該病病原菌。菌株HD0103為革蘭氏陰性菌，無芽孢和莢膜。經(jīng)過分別對生理學(xué)反應(yīng)以及生化學(xué)反應(yīng)特性及16S rDNA基因序列測定，分離病原菌HD0103與弗氏檸檬酸桿菌同源性達(dá)100%，結(jié)合其生理生化特性確定分離病原菌HD0103為弗氏

7、檸檬酸桿菌。弗氏檸檬酸桿菌對磺胺異噁唑、氯霉素、多黏霉素B、環(huán)丙氟哌酸、氟苯尼考、諾氟沙星、阿奇霉素、頭孢噻肟、新霉素、強(qiáng)力霉素、左氧氟沙星、鏈霉素、妥布霉素、慶大霉素、丁胺卡那霉素等15種藥物高度敏感，對痢特靈、紅霉素、卡那霉素等3種藥物中度敏感。該結(jié)果為鱘魚養(yǎng)殖生產(chǎn)中對該病的防治提供了科學(xué)依據(jù)。
　　341種中草藥對鱘3種病原菌體外抑菌效果
　　采用平板打孔法在觀察了弗氏檸檬酸桿菌、魯氏耶爾森氏菌、嗜水氣單胞菌等3種鱘源

8、病原菌對41種中草藥敏感性的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用二倍稀釋法測定了具有良好抑菌活性的中草藥對3種病原菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3種病原菌對烏梅、石榴皮、地榆、杞子等均高度敏感，對杜仲、柴胡、丹參、熟地黃等均中度敏感，對麥冬、當(dāng)歸、胖大海、玉竹均不敏感。此外，烏梅、石榴皮、地榆、杞子對3種病原菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度分別為7.81 mg/mL和15.625 mg/mL、15.625 mg/mL和31.25 mg/mL

9、、15.625 mg/mL和31.25 mg/mL以及15.625 mg/mL和31.25 mg/mL，而杜仲、柴胡、丹參、熟地黃等中度敏感中草藥對3種病原菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度均分別高于31.25 mg/mL和62.5 mg/mL。
　　47種消毒劑對鱘3種病原菌體外抑菌效果
　　為了篩選高效的消毒劑用于防治鱘細(xì)菌性疾病，采用二倍稀釋法測定了7種消毒劑對鱘3種病原菌的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌質(zhì)量濃度（MBC

10、）。結(jié)果顯示，高鐵酸鉀對鱘3種病原菌抑菌效果最好，MIC為8 mg/L，MBC為8-16 mg/L，戊二醛、甲醛、苯扎溴銨、過氧化氫及季銨鹽絡(luò)合碘5種消毒劑抑菌效果中等，聚維酮碘對鱘3種病原菌抑菌效果最差，聚維酮碘對鱘3種病原菌的MBC最大值為2048 mg/L。根據(jù)上述研究結(jié)果，選擇抑菌效果好的消毒劑高鐵酸鉀進(jìn)一步研究了鱘3種病原菌隨時(shí)間和高鐵酸鉀濃度變化的生長趨勢，顯示消毒液濃度為5 mg/L、9 mg/L的消毒液在短時(shí)間能抑制病原