半夏軟腐病的病原菌鑒定及其生物防治初探.pdf

1、半夏(Pinellia ternata(Thunb．)．Breit．)為天南星科半夏屬植物，是我國中藥寶庫中的大宗藥材，已收入《中國藥典》。半夏還是一種主要的出口創(chuàng)匯藥材，目前國內(nèi)外兩個市場的年需求量為5,500噸～6,000噸，較20世紀90年代增長了50﹪以上。然而，多年來由于過度采集及環(huán)境的破壞，野生半夏資源已近枯竭，半夏原料供不應求，半夏偽品充斥市場，造成半夏用藥的嚴重混亂和安全隱患。為解決供需矛盾和保護野生資源，我國從20世紀

2、70年代開始半夏野生變家種及其栽培技術(shù)研究。在半夏規(guī)?；N植中，不少技術(shù)瓶頸如品質(zhì)衰退、病害發(fā)生嚴重，增加了半夏栽培風險，其中軟腐病的危害最為嚴重。為此，我們對半夏軟腐病的病原及其發(fā)生情況進行了研究。 2005年對幾個半夏主產(chǎn)地(山西、甘肅、山東、四川、浙江、安徽和江蘇等)的主要種植基地進行了軟腐病原的調(diào)查。對這些基地隨機采集的半夏球莖進行細菌分離和致病性試驗，結(jié)果從山西、甘肅、山東、四川、浙江、安徽、江蘇和河南等地的半夏樣品中

3、分別獲得52、63、57、69、55、66、51和53個分離物，其中同一地方的樣品中有2-3種菌的分離頻率較高。煙草過敏性試驗表明，山西、甘肅、山東、四川、浙江、安徽、江蘇和河南等地的分離物中分別有12、3、6、2、6、6、5和3個分離物可引起煙草產(chǎn)生過敏性反應；其中可引起半夏組織軟腐的分離物分別有9、3、6、2、6、4，4和3個?？梢?，各種植基地的半夏樣品均帶有軟腐病原菌。山西，甘肅，山東，四川，浙江，安徽，江蘇和河南各種植基地半夏球

4、莖的帶病率分別為36﹪、12﹪、24﹪、8﹪、24﹪、16﹪、16﹪和12﹪。2006年從帶病率較高的浙江、山西和山東種植基地采集發(fā)病樣品進行病原菌的分離與鑒定。結(jié)果從浙江、山西和山東樣品中分別獲得8、12和13種細菌分離物。致病性試驗表明，分離物SXR1、SXR2、SXR4、ZJR1、ZJR3、ZJR4、ZJR9、SDR1、SDR2、SDR5、SDR10使煙草葉片發(fā)生過敏性反應。其中，分離物ZJRl、SXRl和SDR1可使半夏球莖切片

5、發(fā)生軟腐，并伴隨惡臭，發(fā)病率為100﹪。它們也可引起半夏植株發(fā)生與田間相似的軟腐癥狀，主要表現(xiàn)為：植株出現(xiàn)水漬狀壞死、倒伏、軟化和腐爛，并伴隨惡臭；球莖發(fā)生水漬狀壞死、腐爛，最后只留下表皮空殼；根部出現(xiàn)半透明、軟化和腐爛。無論是半夏組織還是植株，分離物ZJRl和SXRl引起的發(fā)病過程較快，SDRl發(fā)病則相對較慢?？梢姺蛛x物ZJR、SXR和SDR1是引發(fā)浙江、山西和山東半夏軟腐的病原菌。這3個病原菌對胡蘿卜、蘿卜，土豆，青椒、番茄、黃瓜、

6、掌葉半夏和芋頭也有浸染性，引起軟腐病害，但對洋蔥和生姜沒有浸染性。應用傳統(tǒng)方法和分子生物學方法對病原菌ZJR1、SXR1和SDR1進行了鑒定。從形態(tài)上，病原菌ZJR1、SXR1和SDR1與胡蘿卜果膠桿菌胡蘿卜亞種一致：菌落光滑、邊緣整齊、稍凸起、半透明、有光澤，沒有色素產(chǎn)生；革蘭氏陰性桿菌，周生鞭毛。生理生化特征方面，3個病原菌與胡蘿卜果膠桿菌胡蘿卜亞種基本相似，除了3個病原菌的最高生長溫度(39℃)高于己報道的胡蘿卜果膠桿菌胡蘿卜亞種

7、菌株，以及對幾種碳源的利用情況不同。BIOLOG系統(tǒng)鑒定結(jié)果表明，病原菌ZJR1和SXR1對95種碳源的利用情況相同；病原菌ZJR1、SXR1和SDR1與胡蘿卜果膠桿菌胡蘿卜亞種最相似，相似性分別為61.6﹪、63.5﹪和66.9﹪；但它們與該亞種的部分碳源利用情況有所不同，表明它們既相關(guān)又相區(qū)別。脂肪酸成分分析(MIDI鑒定系統(tǒng))也表明，3個病原菌與胡蘿卜果膠桿菌胡蘿卜亞種的相似性最大，分別為72.9﹪、78.2﹪和77.9﹪，但它們

8、的主要脂肪酸比值卻與之不同。16S rRNA基因序列同源性分析表明，病原菌ZJRl和SXRl與胡蘿卜果膠桿菌胡蘿卜亞種的同源性最大，但僅為97.6﹪，不在一個種的界定范圍。鄰近法(NJ)、最大相似法(MP)和最大簡約法(ML)所構(gòu)建16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，也表明這2個病原菌與胡蘿卜果膠桿菌親緣關(guān)系相近，其中與P．carotovorum subsp．carotovorum 和 P．carotovorum．subsp．odrife

9、rum亞種最近，但自成一簇。PCR-RFLP鑒定結(jié)果表明病原菌ZJR1和SXR1與P． carotovorum subsp．odriferum不相關(guān)，而與P．carotovorum subsp．carotovorum相關(guān)。以上生理生化和分子生物學鑒定結(jié)果均表明，病原菌ZJR1、SXR1和SDR1與胡蘿卜果膠桿菌胡蘿卜亞種高度相關(guān)，但又與之區(qū)別，我們推測這些病原菌是胡蘿卜果膠桿菌胡蘿卜亞種的變種。 為探索半夏軟腐病的生物防治途徑，