膿毒癥早期大鼠下丘腦室旁核一氧化氮合酶表達(dá)的變化及烏司他丁干預(yù)的影響.pdf

1、目的：膿毒癥(Sepsis)是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征(Systemicinflammatory response syndrome，SIRS)，也是嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、休克、大手術(shù)后常見的并發(fā)癥之一[1，2]，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚無特效療法，病死率極高。長期以來，人們不斷探討膿毒癥的發(fā)病機(jī)制，以期尋找有效治療措施，但是結(jié)果難以讓人滿意。神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)理論的出現(xiàn)為我們進(jìn)一步認(rèn)識膿毒癥的發(fā)病機(jī)理提供了新的契機(jī)，在此網(wǎng)絡(luò)研究中下

2、丘腦-垂體-腎上腺軸(Hypothalamic-Pituitary-Adrenal Axis，HPAA)備受關(guān)注[4]。HPA軸作為神經(jīng)－內(nèi)分泌－免疫網(wǎng)絡(luò)的樞紐，在機(jī)體遭受感染、創(chuàng)傷等應(yīng)激反應(yīng)后被激活，而HPA軸激活的起始點(diǎn)在下丘腦室旁核(PVN)，PVN除參與神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)外，還參與自主神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，并為神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)的整合中心。以往研究證明[5，30]，一氧化氮合酶(NOS)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、即刻早期基因(c－

3、fos)共存于PVN，NOS催化產(chǎn)生的NO可能參與了c－fos、CRH的調(diào)節(jié)，進(jìn)而啟動(dòng)HPA軸。亦有研究報(bào)道[6]，膿毒癥早期HPA軸處于過度激活狀態(tài)。通過研究HPA軸在膿毒癥中的變化，將有助于闡明膿毒癥的本質(zhì)，并有望開辟膿毒癥臨床干預(yù)的新途徑。
　　烏司他丁是從健康成年男性新鮮尿液中分離純化出來的一種糖蛋白，其能抑制多種蛋白酶活性，具有減少炎癥介質(zhì)釋放，調(diào)節(jié)過度炎癥反應(yīng)，清除氧自由基，抑制心肌抑制因子產(chǎn)生，減輕組織損傷，促進(jìn)機(jī)體

4、康復(fù)等作用。
　　本研究采用盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)法制備大鼠膿毒癥模型，通過觀察膿毒癥早期大鼠PVN內(nèi)NOS表達(dá)的變化，探討NO在膿毒癥早期HPA軸激活中的作用及其機(jī)制，并觀察烏司他丁對PVN內(nèi)NOS表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討烏司他丁對創(chuàng)傷、膿毒癥早期大鼠HPA軸的調(diào)節(jié)作用。
　　方法：大鼠膿毒癥模型的制備采用經(jīng)典的盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)法，健康清潔級雄性Wistar大鼠40只，體重200～250g之間，按體重編號隨機(jī)分為4組：

5、(1)對照組(Control group)：不給予任何處理，直接處死；(2)假手術(shù)組(Sham group)：只開腹，拉出盲腸，翻動(dòng)腸管，不結(jié)扎和穿孔盲腸，關(guān)腹；(3)鹽水組(NS group)：CLP術(shù)后腹腔注射生理鹽水(10ml/Kg)；(4)烏司他丁組(UTI group)：CLP術(shù)后腹腔注射烏司他丁10萬U/Kg(藥物濃度為1萬U/ml)。除對照組外，各組均術(shù)前頸總動(dòng)脈置管，觀察血壓和心率。各組術(shù)后均在股部皮下注射生理鹽水30m

6、l/kg，補(bǔ)充術(shù)中液體丟失量和生理需要量。各組均于術(shù)后6h麻醉后斷頭活殺，冰臺(tái)操作，立體顯微鏡下分離出下丘腦室旁核，用錫紙包裹后放入液氮中保存。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription polymerase chain raction，RT-PCR)半定量檢測PVN內(nèi)nNOSmRNA、iNOSmRNA、c－fosmRNA、CRHmRNA表達(dá)水平。Western blot檢測PVN內(nèi)nNOS、iNOS、c－fos、C

7、RH蛋白表達(dá)水平。
　　所得數(shù)據(jù)采用SPSS13.0版統(tǒng)計(jì)軟件(SPSS Company，Chicago，Illinois，USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示，方差齊時(shí)，各組均數(shù)的比較行單因素方差分析(ANOVA)，方差不齊時(shí)采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，用最小顯著性差異法行兩兩比較。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.大鼠術(shù)后一般情況觀察：
　　假手術(shù)組大鼠術(shù)后清醒較早，活動(dòng)

8、基本如常。鹽水組大鼠術(shù)后蘇醒延遲，精神萎靡，活動(dòng)明顯減少，眼角分泌物增多，豎毛，呼吸急促，動(dòng)物處死剖腹可見血性滲出液，腸管脹氣、水腫，部分盲腸末端發(fā)黑壞死，有惡臭。烏司他丁組大鼠膿毒癥表現(xiàn)較鹽水組大鼠表現(xiàn)輕。
　　2. CLP術(shù)后6h PVN內(nèi)nNOSmRNA、iNOSmRNA、c-fosmRNA、CRHmRNA表達(dá)水平變化：
　　鹽水組iNOSmRNA表達(dá)水平高于假手術(shù)組和對照組iNOSmRNA表達(dá)(1.25±0.05 V

9、S0.85±0.05，1.25±0.05 VS0.77±0.07，均P<0.05)，烏司他丁組iNOSmRNA表達(dá)水平低于鹽水組iNOSmRNA表達(dá)(0.57±0.04VS1.25±0.05，P<0.05)，假手術(shù)組iNOSmRNA表達(dá)水平高于對照組iNOSmRNA表達(dá)(0.85±0.05 VS0.77±0.07，P<0.05)(Fig.3；Fig.10：Table1)。
　　鹽水組nNOSmRNA表達(dá)水平低于假手術(shù)組和對照組nN

10、OSmRNA表達(dá)(0.95±0.03 VS1.04±0.02，0.95±0.03 VS1.39±0.03，均P<0.05)，烏司他丁組nNOSmRNA表達(dá)水平高于鹽水組nNOSmRNA表達(dá)(1.44±0.03 VS0.95±0.03，P<0.05)，假手術(shù)組nNOSmRNA表達(dá)水平低于對照組nNOSmRNA表達(dá)(1.04±0.02 VS1.39±0.03，P<0.05)(Fig.4；Fig.10；Table1)。
　　鹽水組c-f

11、osmRNA表達(dá)水平高于假手術(shù)組和對照組c-fosmRNA表達(dá)(分別為1.08±0.08 VS0.68±0.09，1.08±0.08 VS0.31±0.1，均P<0.05)，烏司他丁組c-fosmRNA表達(dá)水平低于鹽水組c-fosmRNA表達(dá)(0.82±0.12VS1.08±0.08，P<0.05)，假手術(shù)組c-fosmRNA表達(dá)水平高于對照組c-fosmRNA表達(dá)水平(0.68±0.09 VS0.31±0.1，P<0.05)(Fig.

12、5；Fig.9；Table1)。
　　鹽水組CRHmRNA表達(dá)水平高于假手術(shù)組和對照組CRHmRNA表達(dá)(分別為0.72±0.06 VS0.39±0.06，0.72±0.06 VS0.33±0.04，均P<0.05)，烏司他丁組CRHmRNA表達(dá)水平低于鹽水組CRHmRNA表達(dá)(0.48±0.05VS0.72±0.06，P<0.05)，假手術(shù)組CRHmRNA表達(dá)水平與對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.39±0.06 VS0.33±0.0

13、4，P>0.05)(Fig.6；Fig.9；Table1)。
　　3. CLP術(shù)后6h PVN內(nèi)nNOS、iNOS、c-fos、CRH蛋白表達(dá)水平的變化：
　　鹽水組iNOS蛋白表達(dá)水平高于假手術(shù)組和對照組iNOS蛋白表達(dá)(分別為1.73±0.18 VS1.28±0.06，1.73±0.18 VS0.76±0.05，均P<0.05)，烏司他丁組iNOS蛋白表達(dá)水平低于鹽水組iNOS蛋白表達(dá)(0.91±0.06 VS1.73±

14、0.18，P<0.05)，假手術(shù)組iNOS蛋白表達(dá)水平高于對照組iNOS蛋白表達(dá)(1.28±0.06 VS0.76±0.05，P<0.05)(Fig.7；Table2)。
　　鹽水組nNOS蛋白表達(dá)水平低于對照組nNOS蛋白表達(dá)(0.46±0.05 VS0.54±0.05，P<0.05)，鹽水組nNOS蛋白表達(dá)同假手術(shù)組比較無意義(0.46±0.05 VS0.52±0.04，P>0.05)，烏司他丁組nNOS蛋白表達(dá)水平高于鹽水組

15、nNOS蛋白表達(dá)(0.66±0.05 VS0.46±0.05，P<0.05)，假手術(shù)組nNOS蛋白表達(dá)同對照組比較無差別(0.52±0.04 VS0.54±0.05，P>0.05)(Fig.7；Table2)。
　　鹽水組c-fos蛋白表達(dá)水平高于假手術(shù)組和對照組c-fos蛋白表達(dá)(分別為0.77±0.02 VS0.64±0.05，0.77±0.02 VS0.33±0.04，均P<0.05)，烏司他丁組c-fos蛋白表達(dá)水平低于鹽

16、水組c-fos蛋白表達(dá)(0.71±0.04 VS0.77±0.02，P<0.05)，假手術(shù)組c-fos蛋白表達(dá)水平高于對照組c-fos蛋白表達(dá)(0.64±0.05 VS0.33±0.04，P<0.05)(Fig.8；Table2)。
　　鹽水組CRH蛋白表達(dá)水平高于假手術(shù)組和對照組CRH蛋白表達(dá)(分別為1.41±0.10 VS0.99±0.11，1.41±0.10VS0.84±0.11，均P<0.05)，烏司他丁組CRH蛋白表達(dá)水

17、平低于鹽水組CRH蛋白表達(dá)(1.21±0.15 VS1.41±0.10，P<0.05)，假手術(shù)組CRH蛋白表達(dá)水平高于對照組CRH蛋白表達(dá)(0.99±0.11 VS0.84±0.11，P<0.05)(Fig.8；Table2)。
　　結(jié)論：
　　1.本實(shí)驗(yàn)采用CLP法可成功復(fù)制膿毒癥大鼠動(dòng)物模型。
　　2.膿毒癥早期，大鼠PVN內(nèi)iNOSmRNA、c-fosmRNA、CRHmRNA表達(dá)升高，nNOSmRNA表達(dá)降低，且

18、蛋白與基因表達(dá)一致，表明PVN內(nèi)NO可能具有雙重作用：一方面iNOS產(chǎn)生的NO誘導(dǎo)c-fos產(chǎn)生，c-fos作為第三信使誘導(dǎo)CRH產(chǎn)生，從而啟動(dòng)HPA軸，并使HPA軸處于過度激活狀態(tài)；另一方面，由于nNOS產(chǎn)生的NO對HPA軸具有抑制作用，創(chuàng)傷、膿毒癥時(shí)nNOS表達(dá)降低，nNOS產(chǎn)生的NO對HPA軸的抑制作用減弱，使HPA軸處于過度激活狀態(tài)。
　　3.烏司他丁可降低膿毒癥大鼠下丘腦PVN內(nèi)iNOS基因及蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制c-fos