煙粉虱不同生物型傳播番茄黃化曲葉病毒機制研究.pdf

1、煙粉虱（Bemisia tabaci）屬半翅目，粉虱科，是一種重大外來入侵害蟲，危害包括蔬菜、花卉、棉花等在內(nèi)的600多種寄主植物。煙粉虱是一種至少由32個生物型（或被稱為隱種）組成的復合種，其中B型和Q型煙粉虱入侵性強，危害也更嚴重。20世紀90年代B型煙粉虱進入我國并給我國園藝作物帶來嚴重經(jīng)濟損失，2005年在我國云南首次發(fā)現(xiàn)了Q型煙粉虱，在隨后的幾年內(nèi)，發(fā)現(xiàn)Q型煙粉虱有逐漸取代B型的趨勢，2009年底我國已經(jīng)至少有21個省市發(fā)現(xiàn)了

2、Q型煙粉取代了B型。與此同時，伴隨著Q型煙粉虱種群的快速擴散，由煙粉虱傳播的番茄黃化曲葉病毒(Tomato Yellow Leaf Curl Virus，簡稱TYLCV)導致的番茄黃化曲葉病毒病在我國從南到北多地發(fā)生并流行蔓延，給我國的番茄生產(chǎn)帶來了巨大的經(jīng)濟損失，局部地區(qū)甚至整棚絕收。然而關(guān)于煙粉虱傳播番茄黃化曲葉病的傳毒機理以及伴隨B、Q型煙粉虱之間的競爭取代而發(fā)生的番茄黃化曲葉病毒病的大發(fā)生機制研究尚不清楚。因此，本研究以目前煙粉

3、虱的主要危害生物型B型和Q型為研究對象，篩選出了鑒別B、Q型以及外形相似的溫室白粉虱的分子標記，比較了B型和Q型煙粉虱在不同時間內(nèi)對TYLCV的獲毒能力以及煙粉虱傳播TYLCV相關(guān)基因GroEL的表達，同時運用RNA干擾技術(shù)對GroEL基因進行功能驗證，研究結(jié)果為進一步闡明煙粉虱對TYLCV的傳播機制補充了資料，也為煙粉虱傳播番茄黃化曲葉病毒病的預防和控制提供理論指導和科學依據(jù)。主要結(jié)果如下:
　　 1三種粉虱類害蟲的RAPD標

4、記研究:
　　 通過RAPD檢測，從120條隨機引物中篩選出2條種間特異性很強的隨機引物，分別為OPA-17(5’-GACCGCTTGT-3’)和OPE-03(5’-CCA GATGCAC-3’)，它們作為最適宜的區(qū)分B型、Q型和溫室白粉虱三種粉虱害蟲的RAPD引物，通過優(yōu)化PCR條件，建立了OPA-17對三種不同粉虱害蟲的清晰、不同個體間穩(wěn)定性強且差異明顯的擴增譜，且在多個地方采集的煙粉虱樣本中得到了預期的結(jié)果。
　　

5、 2三種粉虱類害蟲的SCAR標記:
　　 利用上述RAPD分子標記得到的特異性的擴增片段，分別轉(zhuǎn)化為溫室白粉虱、煙粉虱B型、煙粉虱Q型的SCAR標記，成功地建立了適于供試三種粉虱PCR擴增鑒定的特異性引物對，擴增片段分別為412bp，387bp，507bp。這3對引物僅能在特定粉虱體內(nèi)擴增出相應的條帶，且擴增結(jié)果穩(wěn)定，重復性很強。經(jīng)過對田間粉虱害蟲種群的擴增發(fā)現(xiàn)，所建立的溫室白粉虱、煙粉虱B型和Q型的分子標記適用性很強。

6、　　 3采用熒光定量PCR技術(shù)對B、Q型煙粉虱傳播TYLCV的相關(guān)基因GroEL的表達進行研究。結(jié)果表明:在檢測的五個時間段內(nèi)(6h-72h)，Q型煙粉虱的病毒捕獲量均顯著高于B型;病毒獲取量達到飽和的時間也明顯早于B型煙粉虱。表明Q型煙粉虱無論在獲毒能力還是在獲毒時間上均顯著強于B型煙粉虱。熒光定量PCR技術(shù)比較了煙粉虱傳毒相關(guān)蛋白基因GroEL在兩種生物型煙粉虱體內(nèi)表達量的差異，結(jié)果表明在兩種生物型內(nèi)，帶毒個體GroEL基因的表達

7、量顯著高于未獲毒的煙粉虱個體，且該基因在Q型煙粉虱是否獲毒的狀態(tài)下的表達量是B型獲毒狀態(tài)下為1.55倍，非獲毒狀態(tài)下為1.68倍，且差異顯著(P＜0.05)。說明感染TYLCV后，煙粉虱體內(nèi)GroEL的表達量升高，可能顯示二者存在著密切關(guān)系。
　　 4利用RNA干擾技術(shù)對研究了煙粉虱傳毒相關(guān)基因GroEL的表達根據(jù)B型煙粉虱內(nèi)共生菌Hamiltonella所編碼的GroEL基因序列，設(shè)計了特異性引物擴增了B型煙粉虱的GroEL片

8、段，合成相對應的dsRNA，并通過注射的方法將dsRNA導入到煙粉虱偽蛹體內(nèi)，隨后采用RealtimeRT-PCR技術(shù)測定了不同干擾時間后，B型煙粉虱體內(nèi)目的基因mRNA的表達水平。結(jié)果表明:不同劑量的dsRNA在注射不同時間后的干擾效果有所差異，隨著注射后時間的增加，GroEL基因的mRNA水平都呈現(xiàn)下降的趨勢，且注射dsRNA濃度在3-4ng/μl時，注射GroEL基因的dsRNA后48h后mRNA水平顯著下降60-70％，隨后該基

9、因表達量逐漸恢復，96小時后基本恢復到原來水平。GroEL基因干擾后，煙粉虱對TYLCV的獲取能力和傳播能力的變化尚待深入求證。
　　 5煙粉虱感染TYLCV后生理學特性變化B型煙粉虱和Q型煙粉虱種群獲毒72小時及持續(xù)飼養(yǎng)在帶毒番茄寄主上，測定感染TYLCV對B型和Q型煙粉虱的解毒酶系及保護酶系活性的影響。結(jié)果表明:
　　 (1)解毒酶系的活性: B型和Q型煙粉虱羧酸酯酶(CarE)活性和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的

10、高低順序均為獲毒72小時＞健康番茄種群＞長期帶毒飼養(yǎng)種群，而多功能氧化酶(P450)活性為長期帶毒飼養(yǎng)種群＞獲毒72小時＞健康番茄種群。
　　 (2)保護酶系的活性:B型和Q型煙粉虱過氧化氫酶(CAT)的活性，過氧化物酶(POD)的活性和超氧化物歧化酶(SOD)的活性的高低順序均為長期帶毒飼養(yǎng)種群＞獲毒72小時＞健康番茄種群。
　　 研究結(jié)果暗示了煙粉虱多功能氧化酶和保護酶可能由于受到TYLCV病毒的感染誘導而活性升高，