基于遺傳轉(zhuǎn)化手段防治番茄黃化曲葉病毒的研究

1、 I摘要 摘要番茄黃化曲葉病(Tomato yellow leaf Curl Disease，TYLCD)是由煙粉虱傳播的番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf Curl Virus，TYLCV)引起的、嚴(yán)重危害番茄生產(chǎn)的一種雙生病毒病。 目前防治 TYLCV的危害主要策略是防控?zé)煼凼瓦x育抗 TYLCV番茄品種等措施， 因此研究植物抗蟲性和抗病性的分子機(jī)制對(duì)培育抗病性番茄十分重要。本研究利用遺傳轉(zhuǎn)化的手段，將煙粉虱參

2、與殺蟲劑解毒代謝的細(xì)胞色素 P450 基因 CYP6CM1 和羧酸酯酶基因 Coe1 構(gòu)建 RNAi 載體轉(zhuǎn)化煙草、番茄抗 TYLCV 相關(guān)基因 slIAA4 轉(zhuǎn)化番茄，研究通過轉(zhuǎn)基因途徑實(shí)現(xiàn)抗煙粉虱和抗 TYLCV 的可能性。煙粉虱的抗藥性與其體內(nèi)解毒酶的解毒代謝作用增強(qiáng)密切相關(guān)，細(xì)胞色素 P450酶系和羧酸酯酶系是煙粉虱體內(nèi)的重要解毒酶系。 根據(jù) Q 型煙粉虱的一個(gè) P450 基因( CYP6CM1 基因)和一個(gè)羧酸酯酶基因 （co

3、e1 基因） 的特異區(qū)域構(gòu)建雙價(jià) RNAi 載體，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草，PCR 檢測獲得 5 株獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系；選取卡那霉素抗性較好的 T1 代轉(zhuǎn)基因株系 H1 和 H2 飼喂煙粉虱 5d 后， 熒光定量 PCR 檢測煙粉虱體內(nèi)CYP6CM1 和 coe1 基因的表達(dá)水平， 發(fā)現(xiàn)取食轉(zhuǎn)基因煙草煙粉虱的 CYP6CM1 基因和coe1 基因表達(dá)量僅為取食非轉(zhuǎn)基因煙草煙粉虱的 18%-24%和 17%-33%。通過瓊脂保濕浸葉法和單株活體

4、法進(jìn)一步研究煙粉虱取食轉(zhuǎn)基因煙草后對(duì)殺蟲劑的敏感性， 發(fā)現(xiàn)接觸 1g·L-1 阿維·吡蟲啉 72h 后，取食轉(zhuǎn)基因煙草的煙粉虱死亡率分別比取食非轉(zhuǎn)基因煙草的煙粉虱死亡率顯著升高 14.77%-16.46%和 16.01%-18.51%；同樣，接觸稀釋1000 倍的 40%（v/v）辛硫磷 72h 后，煙粉虱死亡率顯著升高 22.94%-23.58%和17.4%-18.76%。以上結(jié)果表明，轉(zhuǎn) CYP6CM1-coe1

5、 RNAi 基因煙草可以顯著抑制取食煙粉虱體內(nèi) CYP6CM1 基因和 coe1 基因的表達(dá)水平，降低煙粉虱對(duì)煙堿類殺蟲劑阿維·吡蟲啉和有機(jī)磷類殺蟲劑辛硫磷的抗藥性，顯著提高了殺蟲劑防治效果，進(jìn)而提高對(duì)煙粉虱傳播的番茄黃化曲葉病毒的防治效果。植物與侵染植物的病原微生物互作可改變植物體內(nèi)生長素的合成， 而植物生長素含量的改變會(huì)通過系列基因的表達(dá)變化調(diào)節(jié)植株的生理反應(yīng)和生長發(fā)育。本研究對(duì)TYLCV 脅迫下的含 Ty-3 抗性基因番

6、茄品種和感病番茄品種 9210 的轉(zhuǎn)錄組學(xué)差異進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)生長素信號(hào)傳導(dǎo)參與了 TYLCV 與番茄的互作過程，其中一個(gè)屬于Aux/IAA 生長素原初反應(yīng)基因家族的 slIAA4 基因表達(dá)差異明顯。通過 RT-PCR 克隆了抗性番茄的 slIAA4 基因，qRT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn) slIAA4 基因在番茄的根、莖、葉、花中都有較高水平的表達(dá)，并能響應(yīng) TYLCV 的侵染，在煙粉虱接種 TYLCV 0d、3d、5d、7d 時(shí)，slIAA4