16038.基于遺傳轉(zhuǎn)化手段防治番茄黃化曲葉病毒的研究

1、I摘要摘要番茄黃化曲葉病(TomatoyellowleafCurlDisease，TYLCD)是由煙粉虱傳播的番茄黃化曲葉病毒(TomatoyellowleafCurlVirus，TYLCV)引起的、嚴(yán)重危害番茄生產(chǎn)的一種雙生病毒病。目前防治TYLCV的危害主要策略是防控?zé)煼凼瓦x育抗TYLCV番茄品種等措施，因此研究植物抗蟲(chóng)性和抗病性的分子機(jī)制對(duì)培育抗病性番茄十分重要。本研究利用遺傳轉(zhuǎn)化的手段，將煙粉虱參與殺蟲(chóng)劑解毒代謝的細(xì)胞色素P4

2、50基因CYP6CM1和羧酸酯酶基因Coe1構(gòu)建RNAi載體轉(zhuǎn)化煙草、番茄抗TYLCV相關(guān)基因slIAA4轉(zhuǎn)化番茄，研究通過(guò)轉(zhuǎn)基因途徑實(shí)現(xiàn)抗煙粉虱和抗TYLCV的可能性。煙粉虱的抗藥性與其體內(nèi)解毒酶的解毒代謝作用增強(qiáng)密切相關(guān)，細(xì)胞色素P450酶系和羧酸酯酶系是煙粉虱體內(nèi)的重要解毒酶系。根據(jù)Q型煙粉虱的一個(gè)P450基因(CYP6CM1基因)和一個(gè)羧酸酯酶基因（coe1基因）的特異區(qū)域構(gòu)建雙價(jià)RNAi載體，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草，PCR檢測(cè)獲

3、得5株獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系；選取卡那霉素抗性較好的T1代轉(zhuǎn)基因株系H1和H2飼喂煙粉虱5d后，熒光定量PCR檢測(cè)煙粉虱體內(nèi)CYP6CM1和coe1基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)取食轉(zhuǎn)基因煙草煙粉虱的CYP6CM1基因和coe1基因表達(dá)量?jī)H為取食非轉(zhuǎn)基因煙草煙粉虱的18%24%和17%33%。通過(guò)瓊脂保濕浸葉法和單株活體法進(jìn)一步研究煙粉虱取食轉(zhuǎn)基因煙草后對(duì)殺蟲(chóng)劑的敏感性，發(fā)現(xiàn)接觸1gL1阿維吡蟲(chóng)啉72h后，取食轉(zhuǎn)基因煙草的煙粉虱死亡率分別比取食非轉(zhuǎn)基因

4、煙草的煙粉虱死亡率顯著升高14.77%16.46%和16.01%18.51%；同樣，接觸稀釋1000倍的40%（vv）辛硫磷72h后，煙粉虱死亡率顯著升高22.94%23.58%和17.4%18.76%。以上結(jié)果表明，轉(zhuǎn)CYP6CM1coe1RNAi基因煙草可以顯著抑制取食煙粉虱體內(nèi)CYP6CM1基因和coe1基因的表達(dá)水平，降低煙粉虱對(duì)煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑阿維吡蟲(chóng)啉和有機(jī)磷類(lèi)殺蟲(chóng)劑辛硫磷的抗藥性，顯著提高了殺蟲(chóng)劑防治效果，進(jìn)而提高對(duì)煙粉虱傳播

5、的番茄黃化曲葉病毒的防治效果。植物與侵染植物的病原微生物互作可改變植物體內(nèi)生長(zhǎng)素的合成，而植物生長(zhǎng)素含量的改變會(huì)通過(guò)系列基因的表達(dá)變化調(diào)節(jié)植株的生理反應(yīng)和生長(zhǎng)發(fā)育。本研究對(duì)TYLCV脅迫下的含Ty3抗性基因番茄品種和感病番茄品種9210的轉(zhuǎn)錄組學(xué)差異進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)參與了TYLCV與番茄的互作過(guò)程，其中一個(gè)屬于AuxIAA生長(zhǎng)素原初反應(yīng)基因家族的slIAA4基因表達(dá)差異明顯。通過(guò)RTPCR克隆了抗性番茄的slIAA4基因，q