16038.基于遺傳轉(zhuǎn)化手段防治番茄黃化曲葉病毒的研究

1、I摘要摘要番茄黃化曲葉病(TomatoyellowleafCurlDisease，TYLCD)是由煙粉虱傳播的番茄黃化曲葉病毒(TomatoyellowleafCurlVirus，TYLCV)引起的、嚴重危害番茄生產(chǎn)的一種雙生病毒病。目前防治TYLCV的危害主要策略是防控煙粉虱和選育抗TYLCV番茄品種等措施，因此研究植物抗蟲性和抗病性的分子機制對培育抗病性番茄十分重要。本研究利用遺傳轉(zhuǎn)化的手段，將煙粉虱參與殺蟲劑解毒代謝的細胞色素P4

2、50基因CYP6CM1和羧酸酯酶基因Coe1構(gòu)建RNAi載體轉(zhuǎn)化煙草、番茄抗TYLCV相關(guān)基因slIAA4轉(zhuǎn)化番茄，研究通過轉(zhuǎn)基因途徑實現(xiàn)抗煙粉虱和抗TYLCV的可能性。煙粉虱的抗藥性與其體內(nèi)解毒酶的解毒代謝作用增強密切相關(guān)，細胞色素P450酶系和羧酸酯酶系是煙粉虱體內(nèi)的重要解毒酶系。根據(jù)Q型煙粉虱的一個P450基因(CYP6CM1基因)和一個羧酸酯酶基因（coe1基因）的特異區(qū)域構(gòu)建雙價RNAi載體，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草，PCR檢測獲

3、得5株獨立的轉(zhuǎn)基因株系；選取卡那霉素抗性較好的T1代轉(zhuǎn)基因株系H1和H2飼喂煙粉虱5d后，熒光定量PCR檢測煙粉虱體內(nèi)CYP6CM1和coe1基因的表達水平，發(fā)現(xiàn)取食轉(zhuǎn)基因煙草煙粉虱的CYP6CM1基因和coe1基因表達量僅為取食非轉(zhuǎn)基因煙草煙粉虱的18%24%和17%33%。通過瓊脂保濕浸葉法和單株活體法進一步研究煙粉虱取食轉(zhuǎn)基因煙草后對殺蟲劑的敏感性，發(fā)現(xiàn)接觸1gL1阿維吡蟲啉72h后，取食轉(zhuǎn)基因煙草的煙粉虱死亡率分別比取食非轉(zhuǎn)基因

4、煙草的煙粉虱死亡率顯著升高14.77%16.46%和16.01%18.51%；同樣，接觸稀釋1000倍的40%（vv）辛硫磷72h后，煙粉虱死亡率顯著升高22.94%23.58%和17.4%18.76%。以上結(jié)果表明，轉(zhuǎn)CYP6CM1coe1RNAi基因煙草可以顯著抑制取食煙粉虱體內(nèi)CYP6CM1基因和coe1基因的表達水平，降低煙粉虱對煙堿類殺蟲劑阿維吡蟲啉和有機磷類殺蟲劑辛硫磷的抗藥性，顯著提高了殺蟲劑防治效果，進而提高對煙粉虱傳播

5、的番茄黃化曲葉病毒的防治效果。植物與侵染植物的病原微生物互作可改變植物體內(nèi)生長素的合成，而植物生長素含量的改變會通過系列基因的表達變化調(diào)節(jié)植株的生理反應(yīng)和生長發(fā)育。本研究對TYLCV脅迫下的含Ty3抗性基因番茄品種和感病番茄品種9210的轉(zhuǎn)錄組學(xué)差異進行分析，發(fā)現(xiàn)生長素信號傳導(dǎo)參與了TYLCV與番茄的互作過程，其中一個屬于AuxIAA生長素原初反應(yīng)基因家族的slIAA4基因表達差異明顯。通過RTPCR克隆了抗性番茄的slIAA4基因，q