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文檔簡介
1、在海洋生物中,七鰓鰻(lampetra japonica)是迄今所知道的最原始的無頜類脊椎動物,不僅是研究脊椎動物起源與進化的關鍵物種,同時也是研究脊椎動物發(fā)育與分化的最佳模式動物之一。此外,日本七鰓鰻唾液腺分泌的多種活性物質賦予其極為特殊的寄生生活習性。以成功構建的日本七鰓鰻唾液腺cDNA文庫為基礎開展的前期研究中,已證實日本七鰓鰻唾液腺的分泌物質中存在抗凝、抗炎、抗腫瘤以及抗氧化等多種活性分子。然而,對于分泌物中含有的其他蛋白成分及
2、其機制尚不明確。本研究對日本七鰓鰻的唾液腺分泌蛋白的組分進行分析與鑒定,旨在發(fā)現(xiàn)和研究與其特殊的寄生生活方式相適宜的特有功能蛋白質。利用生物信息學和分子生物學等手段從蛋白和基因兩種水平對日本七鰓鰻唾液腺分泌蛋白的組分進行鑒定分析,獲得了分泌物中低含量蛋白的組成信息,并選擇新活性氧調節(jié)基因、血清白蛋白和細胞死亡調節(jié)因子樣蛋白進行克隆、進化、表達和活性分析。這有利于揭示日本七鰓鰻唾液腺分泌的功能基因在同系家族中的起源與進化,并為日本七鰓鰻特
3、殊的寄生生活習性提供更多的理論基礎。
本研究利用SDS-PAGE電泳技術進行日本七鰓鰻唾液腺分泌低含量蛋白的分離,以基質輔助激光解析電離化/飛行時間(MALDI-TOF-MS)質譜測序手段進行低含量蛋白的質譜測序,將結果在Mascot數(shù)據(jù)庫進行串聯(lián)質譜檢索(MS/MS Ion Search),從而鑒定日本七鰓鰻唾液腺分泌低含量蛋白的蛋白組成。選擇的六條膠帶經質譜測序分別獲得了312、129、137、283、299和248個
4、蛋白質肽段,其中重要的匹配記錄分別為20、9、7、9、20和10項;與唾液腺cDNA文庫比較后發(fā)現(xiàn)匹配上的和未匹配上的肽段總數(shù)目皆為19個;最后將未匹配的蛋白重新查詢,最終獲得了細胞骨架蛋白、代謝酶類、細胞周期相關蛋白、細胞增殖、分化和凋亡相關蛋白和脂質代謝相關蛋白等共計21種有意義蛋白。
利用生物信息學手段解析日本七鰓鰻血清白蛋白及類白蛋白基因家族的分子進化與系統(tǒng)發(fā)育,獲得類白蛋白基因家族成員演化圖以及日本七鰓鰻血清白蛋
5、白、鮭魚血清白蛋白以及斑馬魚維生素D結合蛋白結構域水平上三者之間的進化關系,證實了日本七鰓鰻血清白蛋白在進化上獨特而原始的地位。
利用基因工程手段,克隆得到的日本七鰓鰻新活性氧調節(jié)功能基因Lj-Romol開放閱讀框長243 bp,編碼80個氨基酸,分子量大約8.9KDa;具有信號肽,且可作為跨膜蛋白定位于線粒體膜上;一級結構、二級結構預測以及三維立體結構模擬結果均表明了Lj-Romol基因與其他物種的高度同源性;進化水平的
6、分析則驗證了Lj-Romol的原始進化地位;以semi-PCR技術檢測Lj-Romol在日本七鰓鰻各組織中的表達情況,發(fā)現(xiàn)Lj-Romol在日本七鰓鰻各組織中廣泛表達,其中紅細胞中相對表達量最高,且模擬病原菌刺激后各組織中Lj-Romol表達量明顯上調,證明Lj-Romol參與紅細胞的氧化還原信號通路;原核表達沒有獲得Lj-Romol的重組蛋白,揭示其序列中可能含有稀有密碼子;進一步進行真核轉染,發(fā)現(xiàn)Lj-Romol基因的亞細胞定位于線
7、粒體上,初步證實了Lj-Romol參與機體線粒體內的有氧呼吸過程。
利用生物信息學手段研究日本七鰓鰻細胞死亡因子Grimin基因序列的基本性質,證實其為具有疏水性的單層跨膜蛋白,不含信號肽和糖基磷脂酰肌醇錨定位點,具有氧化還原酶活性,在細胞內可作為轉錄子參與能量代謝;二級結構和高級結構都顯示Lj-Grimin具有細胞凋亡因子GRIM19基因家族的標志性特征,并且在進化上高度保守;實時熒光定量PCR法檢測到Lj-Grimin
8、廣泛分布于日本七鰓鰻各組織之中,且在心臟和紅細胞中表達量最高。同時,病原菌刺激后在心臟中表達量明顯上調,提示Lj-Grimin在日本七鰓鰻的生活史中起關鍵作用,并參與病原菌引發(fā)的的免疫防御反應。
日本七鰓鰻唾液腺分泌蛋白的組分分析與鑒定,從蛋白和基因兩個水平上完善了日本七鰓鰻唾液腺分泌蛋白的組成信息,有助于我們深入了解日本七鰓鰻特殊的生活習性及其特殊的進化地位,并為深入研究日本七鰓鰻唾液腺分泌的功能基因和蛋白質組學提供了理
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