體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為角膜上皮細(xì)胞的初步研究.pdf

1、研究背景與目的 角膜上皮再生的來源是角膜緣干細(xì)胞，干細(xì)胞的缺失會導(dǎo)致嚴(yán)重的眼表異常，包括角膜新生血管、角膜結(jié)膜化、角膜潰瘍穿孔以及帶狀角膜病變等。 以自體或同種異體角膜緣移植，因供體來源不足及異體移植引起的排斥反應(yīng)而受限；而單純羊膜移植重建眼表，因無上皮再生來源的干細(xì)胞而不能治療角膜緣嚴(yán)重受損的眼表傷。組織工程技術(shù)的發(fā)展為解決這一問題帶來了希望。 盡管大量研究用角膜緣干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，但細(xì)胞來源的有限性使其應(yīng)用

2、和推廣受到限制。 研究表明，成年人骨髓中存在著多潛能性的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstem cell，MSC)，在體外不同條件下可以定向地被誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、骨、軟骨、肌腱及骨髓基質(zhì)等不同細(xì)胞。這類細(xì)胞來源確切、充足，取材方便，分化潛能大，避免了胚胎干細(xì)胞可能面臨的倫理學(xué)問題，并且因為是自體組織，所以不存在排斥反應(yīng)，可能具有更加良好的應(yīng)用前景。 角膜基質(zhì)是角膜上皮細(xì)胞和

3、角膜緣干細(xì)胞的微環(huán)境，具有維持角膜上皮細(xì)胞特性的作用。角膜基質(zhì)含有多種自分泌和旁分泌細(xì)胞因子及其受體，共同組成了角膜緣基質(zhì)層復(fù)雜的細(xì)胞因子調(diào)控微環(huán)境，維持角膜緣干細(xì)胞的正常分化、繁殖和不進(jìn)入終極分化。 本實驗的目的是利用組織工程技術(shù)體外培養(yǎng)骨髓MSC，與角膜基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)骨髓MSC向角膜上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化，通過對骨髓MSC向角膜上皮細(xì)胞分化潛能的研究，探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為構(gòu)建組織工程化角膜種子細(xì)胞的可行性及其重建角膜上皮的可能

4、性。 方法 （1）采用Percoll密度梯度離心培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合貼壁培養(yǎng)法對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離、純化和原代、傳代培養(yǎng)觀察，免疫細(xì)胞染色。 （2）對體外培養(yǎng)的大鼠骨髓MSC進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、免疫熒光染色檢測表面抗原標(biāo)記，確認(rèn)為培養(yǎng)的細(xì)胞為骨髓MSC。 （3）觀察大鼠骨髓MSC在體外微環(huán)境誘導(dǎo)下，橫向分化為角膜上皮細(xì)胞的情況。將分離培養(yǎng)的大鼠骨髓MSC與角膜基質(zhì)細(xì)胞在Transwell體系中進(jìn)行共培養(yǎng)，使用免

5、疫熒光技術(shù)檢測共培養(yǎng)前后細(xì)胞的分化情況。 結(jié)果 大鼠骨髓MSC可以在體外培養(yǎng)擴(kuò)增，表現(xiàn)出很強(qiáng)的增殖潛能。免疫熒光染色顯示，原代培養(yǎng)的骨髓MSC CD29陽性，CD34、CD45和CK12為陰性，流式細(xì)胞儀顯示，CD29 陽性率為81.56 ％、CD34 為0.10 ％、CD44 為88.77 ％、CD45為0.17％，CD71為10.02％、CD90為98.43、CD133為1.56％。符合骨髓MSC的特征。骨髓MSC與