體外誘導大鼠骨髓間充質干細胞向肝細胞樣細胞方向分化的初步研究.pdf

1、目的： 近年來，肝硬化的發(fā)病率和病死率逐年升高，已成為繼心腦血管和腫瘤之后的又一嚴重威脅人類生命的重大疾病。在我國病發(fā)的肝硬化中，以病毒性肝炎所致的肝硬化最為常見。迄今為止，對于本病的治療尚無良策，主要是采用對癥療法，療效不佳。肝臟移植是目前治療各種終末期肝病的有效方法，但由于供體來源受限，因而限制了臨床肝移植研究的進展。近期國內外研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，

2、BM-MSCs)具有多向分化潛能，在一定條件下經體內、體外誘導可定向分化為成骨細胞、脂肪細胞、神經元樣細胞、心肌細胞等，有望成為治療終末期肝病的一種新型種子細胞。但是不同的分化條件(基礎培養(yǎng)、細胞密度、機械力、生長因子等)對BM-MSCs分化產生很大影響，BM-MSCs在體外被誘導成肝細胞所需的最佳誘導因子以及其用量還值得進一步的研究。 本實驗以此為目的，在體外分離培養(yǎng)BM-MSCs的基礎上，采用不同劑量的肝細胞生長因子(Hep

3、atocyte growth factor，HGF)和成纖維生長因子-2(Fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF-2)分別或聯(lián)合誘導，觀察不同的生長因子及其用量與誘導分化效果的關系，為BM-MSCs臨床治療肝硬化的可行性提供實驗依據。 實驗方法： 一、BM-MSCs的原代及傳代培養(yǎng)選取四周齡、90-100g、雄性、健康的SD大鼠，獲取BM-MSCs，在37℃、5％CO2條件下，用含10％胎牛血清的L

4、-DMEM培養(yǎng)液進行貼壁培養(yǎng)，每隔三天換液一次。當細胞鋪滿全層時，以1:2的比例進行傳代培養(yǎng)，三代后獲取較為純化的BM-MSCs。 二、體外定向誘導BM-MSCs向肝細胞樣細胞方向分化取第3代的BM-MSCs，分為六組分別誘導。調整細胞濃度至3×105分別接種于放有消毒蓋玻片的24孔板內，用含不同生長因子和10％胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)，分組情況如下表： 每隔三天換液一次，定期收集培養(yǎng)液及細胞爬片。 三、鑒定

5、 (一)細胞形態(tài)學加入各種誘導成分后，每天用倒置顯微鏡觀察每組并記錄細胞形態(tài)學的改變。 (二)檢測肝細胞特征性標志物1、細胞糖原染色將誘導后12天、24天留取的細胞爬片進行糖原染色。 2、ELISA將誘導后3天、6天、9天、12天、15天、18天、21天、24天留取的細胞上清夜進行ELISA檢測細胞AFP的分泌。 3、免疫細胞化學將誘導后12天、24天留取的細胞爬片進行免疫細胞化學檢測細胞ALB和CK19的

6、分泌。 實驗結果： 1、成功培養(yǎng)出了BM-MSCs，光學顯微鏡下呈纖維樣細胞形態(tài)，均一性較高，細胞呈平行排列或漩渦狀生長，十天左右可鋪滿全層。經過3次傳代獲得較為純化的BM-MSCs，背景雜細胞明顯減少。 2、第一組到第五組經誘導后，形態(tài)學有了明顯的改變，細胞形態(tài)從棱形，多角形，逐漸向紡錘、不規(guī)則圓形或多角形增多，10天左右出現(xiàn)卵圓形改變，與肝細胞形態(tài)相似。第六組細胞無明顯形態(tài)學變化。 3、第一組到第五組

7、經誘導后，特別是第一、第二和第四組，行免疫細胞化學檢測ALB、CK19以及糖原染色檢測糖原分泌12天均有陽性結果，24天陽性率明顯增高；ELISA檢測AFP，第3天即有分泌，第12天表達最高，以后逐漸減少。第六組無陽性結果。 結論： 1、FGF-2(20ng/ml)、FGF-2(10ng/ml)、HGF(20ng/ml)、HGF(20ng/ml)+FGF-2(10ng/ml)分別能有效地誘導BM-MSCs定向向肝細胞樣細

8、胞方向分化。 2、FGF-2(20ng/ml)比HGF(20ng/ml)具有更強的誘導BM-MSCs向肝細胞樣細胞分化的能力。 3、FGF-2濃度在10ng/ml以上時，對BM-MSCs向肝細胞樣細胞方向分化具有很強的誘導作用，F(xiàn)GF-2濃度在10ng/ml以下時，體外誘導BM-MSCs向肝細胞樣細胞方向分化的作用劇減。 4、FGF-2在體外誘導BM-MSCs向肝細胞樣細胞方向分化時，對細胞形態(tài)學改變影響很大，作