骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為肝樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：通過肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor, HGF）和表皮生長因子（epidermal growth factor, EGF）聯(lián)合應(yīng)用，兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells， BM-MSCs)體外誘導(dǎo)分化為肝樣細(xì)胞，研究兔BM-MSCs誘導(dǎo)為肝樣細(xì)胞的能力，并對誘導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行功能鑒定。同時，將誘導(dǎo)后的肝樣細(xì)胞經(jīng)門靜脈植入肝硬化兔體內(nèi)，

2、從肝功能和肝臟組織切片變化情況觀察這些細(xì)胞對肝硬化兔的的治療作用，以及在肝臟損傷修復(fù)中的應(yīng)用價(jià)值，為終末期肝臟疾病的治療提供種子細(xì)胞。
　　 方法：1．兔BM-MSCs分離，培養(yǎng)及誘導(dǎo)：無菌條件下抽取兔骨髓5ml，采用密度梯度離心法和貼壁培養(yǎng)法獲取兔BM-MSCs，傳代純化、擴(kuò)增。并對第三代BM-MSCs應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測CD29、CD44和CD34，進(jìn)行表型鑒定，然后在HGF和EGF的誘導(dǎo)條件下定期觀察其形態(tài)學(xué)變化，應(yīng)用免疫細(xì)

3、胞染色，Shiff液糖原染色，從肝細(xì)胞的表面標(biāo)志和肝細(xì)胞的合成、分泌功能來檢測誘導(dǎo)情況。2．兔肝硬化模型的建立：28只健康普通級大白兔，雙下肢外側(cè)交替多點(diǎn)皮下注射40％CCl4橄欖油溶液每周2次，連續(xù)8周，期間每2周采集血樣本，檢查肝生化指標(biāo)，8周后隨機(jī)宰殺2只，取肝臟組織做病理學(xué)檢查，檢驗(yàn)建模情況。3．肝硬化兔的細(xì)胞移植：建模成功后，隨機(jī)分為兩組，行開腹術(shù)，實(shí)驗(yàn)組兔經(jīng)門靜脈內(nèi)注射BrdU標(biāo)記的肝樣細(xì)胞，對照組則用相同體積生理鹽水經(jīng)門靜

4、脈注射。術(shù)前、術(shù)后青霉素40萬U/kg肌肉注射，預(yù)防感染。術(shù)后不同時問點(diǎn)采集血樣本，檢查肝生化指標(biāo)。術(shù)后21d將兔處死，取肝臟標(biāo)本，做組織切片行病理學(xué)檢查。
　　 結(jié)果：1．兔BM-MSCs在傳代、純化、擴(kuò)增后體外經(jīng)HGF、EGF的誘導(dǎo)條件下，于21d發(fā)現(xiàn)細(xì)胞呈類圓形，免疫細(xì)胞染色顯示，AFP和ALB表達(dá)均呈陽性，糖原染色亦陽性表達(dá)，表明兔BM-MSCs可以向肝樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化。
　　 2．在建立肝硬化兔模型時，隨著CCl4注

5、射時間的延長，通過觀察肝生化指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)于第8周時，兔AST和ALT值分別為107.5±28.0、187.7±41.5U/L，均顯著升高（P＜0.05），ALB24.9±7.1g/L，顯著降低（P＜0.05）。通過對兔肝臟大體和組織切片的觀察，發(fā)現(xiàn)兔肝臟呈現(xiàn)肝硬化再生結(jié)節(jié)和假小葉。
　　 3．誘導(dǎo)后的肝樣細(xì)胞經(jīng)門靜脈移植后，肝硬化兔的生化指標(biāo)隨時間推移，逐漸好轉(zhuǎn)（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組兔肝生化指標(biāo)與對照組相比較，發(fā)生了明顯的改變(

6、P＜0.05)。BrdU免疫組織化學(xué)染色顯示：在匯管區(qū)和肝索肝竇內(nèi)均可見BrdU陽性細(xì)胞。肝臟病理學(xué)表現(xiàn)為肝寞間隙內(nèi)有少量再生肝細(xì)胞團(tuán)，而對照組肝纖維化未見明顯改變。
　　 結(jié)論：1．兔BM-MSCs經(jīng)含HGF和EGF的誘導(dǎo)體系進(jìn)行誘導(dǎo)21d后，能夠表達(dá)AFP、ALB和糖原等肝細(xì)胞標(biāo)志物，實(shí)驗(yàn)表明兔BM-MSCs具有向肝樣細(xì)胞分化的能力。
　　 3．實(shí)驗(yàn)兔經(jīng)皮下注射CCl48周后，肝臟組織切片呈現(xiàn)典型的假小葉，此方法可以