過表達(dá)DBR2基因?qū)S花蒿青蒿素及其相關(guān)代謝物生物合成的影響.pdf

1、青蒿素(Artemisinin)是從黃花蒿(Artemisia annua L.)中提取出的一種新型倍半萜內(nèi)酯化合物，由于其獨(dú)特的過氧橋結(jié)構(gòu)，對(duì)腦型瘧疾和抗氯喹瘧疾療效顯著并且具有低毒和速效的特點(diǎn)。世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）將以青蒿素為基礎(chǔ)的聯(lián)合療法（Artemisinin Combination Therapies，ATCs）作為治療瘧疾的首選方法，這使得青蒿素市場(chǎng)需求非常巨大。然而，目

2、前青蒿素僅在黃花蒿植株中發(fā)現(xiàn)，且含量很低，只占干重的0.01％-1％。除此以外，由于青蒿素的全化學(xué)合成路線復(fù)雜、成本高、產(chǎn)率低、毒性大等諸多因素，使其很難實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。所以，青蒿素的供應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足患者的需求。因此，致力于提高黃花蒿植株中青蒿素的含量已經(jīng)是植物次生代謝研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。
　　青蒿醛Δ11(13)雙鍵還原酶(Artemisinic aldehydeΔ11(13) reductase，DBR2)是烯醇還原酶家族成員

3、之一，其功能是以青蒿醛為底物，催化生成二氫青蒿醛（二氫青蒿酸的前體），使得代謝流向青蒿素合成方向流動(dòng)。近年來，隨著青蒿素生物合成途徑研究的深入，利用代謝工程技術(shù)手段通過靶點(diǎn)基因進(jìn)行遺傳操作從而獲得轉(zhuǎn)基因高產(chǎn)株系已經(jīng)被證實(shí)是提高青蒿素含量行之有效的方法之一。目前青蒿素生物合成途徑上的幾個(gè)關(guān)鍵酶基因均有轉(zhuǎn)基因研究報(bào)道，然而青蒿醛Δ11(13)雙鍵還原酶基因?qū)η噍锼厣锖铣傻淖饔靡廊蝗狈D(zhuǎn)基因證據(jù)，所以本實(shí)驗(yàn)將通過代謝工程技術(shù)手段，在黃花蒿中

4、過表達(dá)DBR2基因，以期獲得青蒿素含量提高的轉(zhuǎn)基因黃花蒿，并從轉(zhuǎn)基因水平提供DBR2基因功能的直接證據(jù)。
　　本研究根據(jù)NCBI所報(bào)道的相關(guān)DBR2基因序列（登錄號(hào):EU704257），采用RACE技術(shù)，從黃花蒿中克隆了DBR2基因，并對(duì)所克隆出的序列進(jìn)行了分析，結(jié)果與NCBI已報(bào)道的DBR2基因cDNA序列的一致性達(dá)到了96％。構(gòu)建含有目的基因DBR2的高效植物表達(dá)載體pCAMBIA1305-DBR2，并將其轉(zhuǎn)入根瘤農(nóng)桿菌LBA

5、4404菌株中，從而獲得目標(biāo)工程菌LBA4404-pCAMBIA1305-DBR2。以黃花蒿無菌苗葉片為材料，采用葉盤法進(jìn)行黃花蒿的遺傳轉(zhuǎn)化，將DBR2基因?qū)朦S花蒿中;并以8 mg·L-1潮霉素(Hygr)作為抗性篩選壓力，進(jìn)行抗性篩選從而獲得抗性芽，待抗性芽長(zhǎng)至2-3 cm時(shí)將其分離轉(zhuǎn)至MS+NAA(0.05 mg·L-1)+Cef(200 mg·L-1)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根并進(jìn)行多次繼代培養(yǎng)。待農(nóng)桿菌除菌完全后，設(shè)計(jì)跨35S啟動(dòng)子檢測(cè)

6、引物，對(duì)抗性黃花蒿植株進(jìn)行基因組PCR檢測(cè)。在所有的抗性植株中，有7個(gè)黃花蒿株系能同時(shí)檢測(cè)到抗性基因（Hygr）和目的基因（DBR2）并且在這7個(gè)黃花蒿株系中檢測(cè)不到毒區(qū)基因（virD1）表達(dá)，說明轉(zhuǎn)基因苗不存在農(nóng)桿菌污染造成的假陽性，故而將這7個(gè)黃花蒿株系確立為轉(zhuǎn)基因黃花蒿株系并編號(hào)為D1、D2、 D3、D4、D5、D6、D7。為檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株中DBR2基因表達(dá)情況，以RPⅡ作為內(nèi)參基因，熒光定量PCR分析，結(jié)果顯示在所有DBR2過表

7、達(dá)株系中，DBR2基因的表達(dá)量與對(duì)照比較均有顯著性提高。用高效液相色譜儀(HPLC)分析青蒿素等相關(guān)代謝產(chǎn)物的含量，結(jié)果顯示:非轉(zhuǎn)基因黃花蒿植株中青蒿素含量很低(0.94±0.35 mg·g-1，DW)，然而在轉(zhuǎn)基因的7個(gè)株系中青蒿素的含量與非轉(zhuǎn)基因的黃花蒿相比都得到顯著性的提高，其青蒿素干重含量分別是1.92±0.69 mg·g-1、1.50±0.20 mg·g-1、1.73±0.08 mg·g-1、1.91±0.21mg·g-1、1

8、.72±0.30mg·g-1、1.95±0.24mg·g-1、2.14±0.20mg·g-1，其中D7株系青蒿素含量最高達(dá)到了2.14±0.20mg·g-1，是非轉(zhuǎn)基因黃花蒿的2.26倍。二氫青蒿酸作為青蒿素的直接前體物質(zhì)，也應(yīng)得到提高，經(jīng)HPLC檢測(cè)證實(shí)了這一點(diǎn):與非轉(zhuǎn)基因黃花蒿（0.87±0.03mg·g-1，DW）比較，在轉(zhuǎn)基因的7個(gè)株系中，二氫青蒿酸的含量都得到提高，其干重含量分別是1.23±0.20 mg·g-1、1.46±0

9、.36 mg·g-1、1.39±0.39 mg·g-1、1.09±0.27 mg·g-1、1.51±0.38 mg·g-1、1.50±0.16 mg·g-1、1.93±0.19 mg·g-1。在這7個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中，二氫青蒿酸含量最高可達(dá)1.93±0.19 mg·g-1，是非轉(zhuǎn)基因黃花蒿的2.22倍。然而，意外地發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)DBR2基因使得處于青蒿素生物合成競(jìng)爭(zhēng)途徑上的代謝產(chǎn)物（青蒿素B及其前體物質(zhì)青蒿酸）含量也都得到提高，尤其是青蒿酸的